Способ получения меченных @ т @ моноклональных антител

 

Изобретение относится к радиоиммунологии и касается способа получения меченных Тс моноклональных антител. Целью изобретения является повышение качества введения метки. Смешивают 9тТс пертехнетат и раствор предварительно обработанного моноклонального антитела или их F(ab -фрагмента в присутствии солей олова-11.В качестве солей оло- -ва-П используют соли олова-11 Метандифосфоновой кислоты или 3 3-ДифоСфонопро пионовой кислоты, или 3,3-Дифосфоно1- 1,2-пропандикарбоновой кислоты или пропан-1,1,3,3-тетрафосфоновой или пирофосфоновой кислоты. На 1 мг белка антитела добавляют 5-Ю мкг соли олова-II. Использование предлагаемого способа позволит повысить прочность мечения 9|ЯТс моноклональных антител или их F(ab )2-Фрагментов. 3 табл.

505 А 61 К 43/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К IlATEHTY р,..= Ф 1ф . ):,ф, ф„ЯЯ)З СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК г-, ф2

/-

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТНРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР! (21) 4203840/14 (2Z) .09.12 87 (31 ) P 3642173 ° 1 (32) 10.12.86 (33) DE (46) 07.02.92, Бюл. и 5 (71) Хехст АГ (РЕ) (72) Карл-Хайнц Бремер, Людвиг

Кульманн, Александер Шварц и Акссль Штайнштрэсер (ЭЕ) (53) 616-097(088.8) (56) Патент СНА и 4478815, кл. А 61 К 43/00, опублик. 23.10.84. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕННЫХ Тс

МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ (57) Изобретение относится к радиоим- мунологии и касается способа получе-: ния меченных Я "Тс моноклрнальных

Изобретение относится к медицине,! а именно к радиоиммунологии, и каса-: ется способа получения. меченных Тс моноклональных антител.

Целью изобретения является повы-;

1 шение качества введения метки.

Пример 1. 20 r направленного против карцино-эмбрионального анти« гена (СЕА) моноклонального антитела

ВИ431/31, которое находит применение для диагностического обнаружения колоректальных карцином, при комнат-: ной температуре путем диализа освобождают от добавок (таких как сахароза) и переводят в изотонический раствор хлорида натрия, „,5U„„1711657 Д 3

2 антител. Целью изобретения является повышение качества введения метки, Смешивают Tr. пертехнетат и раствор предварительно обработанного моноклонального антитела или их

F(ab ) -фрагмента в присутствии солей олова-II. качестве солей олова-II используют соли олова-II метандифосфоновой кислоты или3,3-дифосфонопро пионовой кислоты, или 3,3-дифосфоно

1,2-пропандикарбоновой кислоты или пропан-1,1,3,3-тетрафосфоновой или пирофосфоновой кислоты. На 1 мг белка антитела добавляют 5-10 мкг cîëè олова-II. Использование предлагаемого способа позволит повысить прочность .мечения Тс моноклональных антител или их F(ab ) -фрагментов.

3 табл. ф

Имеющееся затем в концентрации примерно 5 мг/мл антитело вводят во взаимодействие с 20 мг 2-меркаптоэтанола при комнатной температуре (30 мин) и после этого путем гельфильтрации на биогеле Р"2, полиакрил-, амидном геле фирмы .БИО РАД, отделяют от избыточного восстановиТеля.;

Растворенное в 0,02 М фосфатном буфере (рН 7,2) антитело сразу отделяют и лиофилизируют. Высушенные путем вымораживания пробы содержат на до- 4Ф зировку 2 MI антитела и примерно

1,4 мг динатрийгидрофосфата.

Для мечения технецием-99ш пробы вводят во взаимодействие с 7,5 мл раствора пертехнетата (примерно

1711657

3000 ИВ q) ° В качестве олово-II-компо- ненты используется лиофилиэированная метящая единица, состоящая из 5 мг натриевой соли 3,3-дифосфонопропионовой кислоты, 01,1 мг катионов олова-II и 0,5 мг N-(4-аминобензоил)-1. глутаминовой кислоты. Эту смесь растворяют в 5 мл физиологического раствора хлорида натрия и затем до- 10 бавляют (спустя 1 мин) 0,5 мл этого раствора к раствору антитела до общего объема 8 мл. После 10-минутной реакции путем тонкослойной хроматографии, гель-фильтрации на биогеле 15

Р-10 и жидкостной хроматографии высокого давления на Zorbax GP-250 фирмы Дюпон определяют выход меченного "Тс антитела,в которой свыше 953 технеция-99м свя зыва ется с протеином, пример- щ но 14 находится в виде связанных с

Фосфонатом частей и менее 14 пертехнетата. Доля пертех, :етата снова возрастает лишь при более продолжительном периоде выдерживания, спустя 25

6 ч приблизительно составляет 24, в то время как связанная с фосфонатом часть остается неизменной (13).

Определение иммунореактивной доли в различных меченных технецием-99м антителах путем измерения связывания с клетками опухолей даст хорошо совпадающие значения для иммунореактивности с соответствующими меченными, иодом-131 и индием-III СЕА-антителами, данные приведены в табл.1.

П р и и е р 2. для мечения 9 Тс направленного против ассоциированно= го с карциномой поджелудочной железы Mucus-антигена, моноклонального антитела ВЫ494/32, 20 мг этого вещест,ва, растворенные в 2мл изотонического раствора хлорида натрия, инкубируют с

0,5 мл 16-ного водного раствора цис" теамингидрохлориде в течение 20 мин при комнатной температуре. Очищенное с помощью колоночной хроматографии модифицированное антитело, растворенное в 0,02 И буферном растворе Ба НРО, лиофилиэируют порциями по 2 мг. В качестве олово-1Х-компоненты для ,мечения технецием антитела используют метящий набор с пирофосфатом, котаРый сожержит ? мг Na4P Oy и

1,03 мг хлорида олова-II на набор.

Содержимое дозировки (упаковки) растворяют в 10 мл физиологического раствора хлорида натрия и 0,25 мл (примерно I4 мкг sn ) этого раствора добавляют к антителу, которое предварительно растворено йримерно в 8 мл раствора пертехнетата (примерно

2000 NBq). После 10-минутной реакции 11,1 мл раствора следующего состава, мкг: mab 25, Na P<0 2,25, оло- во-II 0,175, буфер Na ÍÐO, вводят внутривенно здоровым крысам. Распределение по органам спустя 24 ч после. инъекции показано в табл.2.

Из данных табл.2 следует, что накопления в костях, щитовидной железе и желудке очень незначительные, а в остальных органах меченные иодом131 антитела сравнимы. Для иммунореактивности (см.табл.1) в случае меченного технецием-99m антитела

89494/32 измерено более высокое значение, чем в случае мечения иодом131 или индием-III

Пример 3, 50мг также направ». ленйого против СЕА моноклонального антитела BM431/26 частично восстанавливают путем обработки 2-меркаптоэтанолом, очищают и лиофилизируют в дозах по 2. мг в присутствии фосфатного буфера (РН 7,2).

Иечение Тс осуществляют с помощью используемой обычно для сцинтиграфии печени метящей единицы, состоящей иэ 13,5 мг тетранатриевой соли 1,1,3,3-пррпантетрафосфоновой кислоты.-и 0,6 мг хлорида олова-II 2 Н о.

Содержимое метящей единицы раст-. воряют в 10 мл изотонического раст" вора NaC1. и 0,5 мл (15 мкг $п ) добавляют к лиофилизированному антителу. Затем Раствор пертехнетата (3000 MB q) добавляют к прозрачному . раствору антитело - соло олова-II и меченное технецием-99m антитело вводят внутривенно безволосым мышам с имплантированной человеческой карциномой толстой кишки. Сцинтиграфически опухоль определяют спустя 24 ч после инъекции. В табл.3 приведены данные о накоплении,в опухоли и распределении по органам I-131, In-III и Тс-99ш — mab 431/26 в безволосых мышах (n=2) с человеческой карциномой толстой кишки в зависимости от времени.

Пример 4.. 20 мг F(ab ) -фрагмента моноклонального антитела

1?11657

Таблица1 е»

Иммунореактивность,Ъ, антител, меченных изотопами

Ионоклональные антитела

I-131 In-III Тс-99ш

BW431/31 85 75 90

BW431/26 85

BW494/32 65

70

431/31 инкубируют при 4 С в течение

15 мин с 1 мл 1Ф-ного раствора цистеамингидрохлорида. Освобожденный от избыточного восстановителя фрагмент антитела лиофилизируют вместе с фосфатным буфером. Я я мечения технецием используют метящую единицу, состоящую из 13,0 мг тетранатриевой соли 3,З-дифосфоно-1,2-пропандикар- 10 боновой. кислоты, 0,23 мг оксида олова-II и 1,0;мг мононатриевой соли N-(4-аминобензоил)-L-глутаминовой кислоты, из которой 1/20 применяют в 0,5 мл физиологического раствора . t5 хлорида натрия. Меченный с удельной активностью 1000 ИВ ц/мг фрагмент антитела не содержит практически никакого партехнетата, однако содержит примерно 33 Тс-99m-дифосфоната. Иммунореактивность 603.

Пример 5. Тс-99m-мечение протеина.

250 мг IgG концентрации 10 мг/мл растворяют в изотоническом растворе хлорида натрия. Этот раствор после добавки 0,5-1 мл 2-меркаптоэтанола инкубируют примерно 30 мин при 425©С. Затем восстановленный иммуно-. глобулин очищают путем .гель-фильтра- 30 ции через колонку с гелем полиакриламида (биогель P-2 фирмы БИО РАД),, причем элюируют с помощью 0,02 И раствора динатрийгидрофосфата (РН 7,2)

В отделенной чистой фРакции IgG пу" тем разбавления .таким же фосфатным буфером устанавливают концентрацию

4 мг IgG/en (примерно 3 мг йа НРО4/мл) дозируют, по 0,5 мл этого раствора и лиофилизируют.

Для мечения технецием-99m пробы (2 мг IgG) лиофилизат растворяют,в

1 мл раствора метандифосфоната оло\ ва-II (РН 7), который получается путем растворения метящей единицы, состоящей из 2,6 мг натриевой соли метандифосфоновой кислоты и 0.04 мг хлорида олова-II в 5 мл изотонического раствора хлорида натрия. Затем добавляют 4-9 мл раствора Тс-99mпертехнетата (примерно 1000 NBq) .

После 5 мин реакции получают меченный технецием-99m IgG, в .котором имеется более 954 связанного с про" теином технеция, менее 1Ф связанной с фосфонатом части и менее 1Ж свободного пертехнетата. Меченный IgG стабилен вплоть до 3 ч после. приготовления. Лишь при более длительном времени хранения в растворе обнаруживается снова свободный пертехнетат.

Использование предлагаемого способа позволяет повысить прочность мечения 9 Тс моноклональных антител или их F(ab } -фрагментов.

Формула изобретения

Способ получения меченных п Тс моноклональных антител путем смешения Тс пертехнетата и раствора предварительно обработанного моноклонального антитела или его F(ab ) -фрагмента в присутствии солей олова-II, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения качества введения метки, используют соль олова-II, выбранную из группы: соль олова-II метандифосфоновой кислоты, 3-3-дифосфонопропи" оновой кислоты, 3-3-дифосфоно"1,2-прЬ пандикарбоновой кислоты, пропан-1,13,3-тетрафосфоновой или пирофосфорной кислота в количестве, в расчете на олово-II, 5-10 .мкг соли на 1 мг белка антитела.

1711657 8Таблица 2

Распределение по органам, Ф/r ткани

Орган

Тс-99ш I-131 р

Мышцы

Желудок (Ф в целом) 0 38

?,50

Щитовидная железа

Кишечник

4,85

4,62

49,3

0 05

3,83

24,5

Моча

Тдбли.ца 3

Орган

Тс-99m

17 ч 48 ч

17 ч 48 ч

Опухоль, Фlг

14,9 8,8 9,8 13,0 11,0 14,9

Печень, Ф/г

4,6 3,0 8,5 8,4 72 5 4

Почки, Ж/г

3,4 1,9 12,2 16,4, 10-,6 7,7

13 084 14 12 09 10

Мускулы, Ф/r

17,0 15,0 !

Кровь, 3/мл

14,6 .13,0 20,5 9,2

Кости, Ф в целом

1,8 1,7 4,7 4;3 2,4 2,1

Печень

Легкие

Селезенка

Почки

Кости

К овь

0,49

0,82

0,65

4,?5

0,5 7

l 97

0,12

0,23

0,48

0 30

0,70

0,20

0,92

0,08