Способ серодиагностики коксаки в инфекций

 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использованодля улучшения серодиагностики энтеровирусных инфекций. Цель изобретения - повышение точности диагностики. В культуру фибробластов эмбриона человека вносят индикаторный вирус, содержащий разведения исследуемой сыворотки. В качестве индикаторного вируса используют трипсинзависимый вариант вируса Коксаки В2 (Ohio-1) и при увеличении титров антител в парных сыворотках диагностируют Коксаки В инфекцию. По сравнению с прототипом увеличивается точность диагностики на 23% при локализации инфекции в оболочках головного мозга и на 23% при другой локализации инфекции.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 и 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ.

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4707211/14 (22) 19.06,89 (46) 23.02.92. Бюл. N 7 (71) Молдавский научно-исследовательский институт профилактической и клинической медицины (72) К.И.Спыну, В,П.Вуткарев, Т.П,Грушко и

С,С.Кострица (53) 615.475 (088.8) (56) Ворошилова M.Ê. и др. Методы лабораторной диагностики энтеровирусных инфекций. — М.: Медицина. (54) СПОСОБ СЕРОДИАГНОСТИКИ КОКСАКИ В ИНФЕКЦИИ (57) Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано

Изобретение относится к медицинской вирусологии и может быть использовано для улучшения серодиагностики энтеровирусных инфекций.

Целью изобретения является повышение точности способа. Способ осуществляют следующим образом.

В качестве вируса с высокой инфекционной активностью используют вариант вируса Коксаки В2 (Ohio-1), в поддерживающую среду которого добавляют 50 мкг/мл трипсина.

Предлагаемый вариант вируса Коксаки

В2 выделен от больного серозным менингитой в культуре клеток фибробластов эмбрионов человека. (ФЭЧ), в питательную среду которых было добавлено 50 мкг/мл трипсина. Вариант вируса в указанной культуре

„„« Ы„„1714509 А1 для улучшения серодиагностики энтеровирусных инфекций. Цель изобретения — повышение точности диагностики. В культуру фибробластов эмбриона человека вносят индикаторный вирус, содержащий разведения исследуемой сыворотки. В качестве индикаторного вируса используют трипсинзависимый вариант вируса Коксаки

В2 (Ohio-1) и при увеличении титров антител в парных сыворотках диагностируют Коксаки B инфекцию. По сравнению с прототипом увеличивается точность диагностики на

23 ) при локализации инфекции в оболочках головного мозга и на 23 Д при другой локализации инфекции. прошел более 25 пассажей. Данный штамм вируса Коксаки В2 депонирован в Государственной коллекции вирусов Института вирусологии им.Д,И,Ивановского АМН СССР.

Пример, Проводили серодиагностику у 32 больных серозным менингитом. Для этой цели исследовали парные сыворотки от этих больных, собранные в первые дни болезни и в период реконвалесценции (через

2-3 недели), на наличие вируснейтрализующих антител к вирусу Коксаки В2.

Приготовление культуры клеток ФЭЧ осуществляют следующим образом. Ткани туловища и конечностей плода 2-4 мес. беременности измельчают ножницами до мелких кусочков размером 2-4 мм, затем промывают 3 раза в растворе Хенкса; рН

7,4. Измельченную ткань трипсинизируют.

Для этого к ткани, находящейся в трипси1714509 низационной колбе, добавляют 50,0 мл

0,25 -ного раствора трипсина и перемешивают в течение 5 мин с помощью магнитной мешалки. После осаждения ткани первую порцию надосадочной жидкости отбрасывают. Затем к осадку добавляют 50-70 мл

0,25 -ного трипсина и перемешивают на магнитном смесителе при комнатной температуре в течение 20 мин, Полученную суспензию, состоящую из клеток, переливают в центрифужные пробирки, клетки осаждают центрифугированием при 2500-3000 об/мин е течение 10 мин, Надосадочную жидкость отбрасывают, осадок ресуспендируют в небольшом объеме (50,0 мл) раствора

Хенкса (рН 7,4) и помещают в холодильник до смешивания с клетками последующих зкстракций, К ткани, оставшейся в колбе, добавляют свежий раствор трипсина и повторно произ5

20 водят экстракцию. Экстракцию повторяют

2-3 раза. Смешанную суспензию клеток, полученную после всех экстракций, центрифугируют при 2500-3000 об!мин в течение

10 мин, надосадочную жидкость отбрасыва- 25 ют, клетки ресуспендируют е среде, содержащей 0,5 -ный раствор гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса (рН 7,0).

Осадок ресуспендируют в питательной среде для выращивания. клеток до концентра- 30 ции 250 тыс..клеток в 1,0 мл. В качестве среды для выращивания клеток используют среду, содержащую 0,5 гидролизата лактальбумина на,растворе Хенкса, рН 7,0 и среду 199 на растворе Хенкса, рН 7,2, в 35 каждую из которых добавляют сыворотку крупного рогатого скота до 10,0 и антибиотики из расчета 25 тыс. ед. пенициллина и

25,0 мг стрептомицина на 100,0 мл среды.

Культуру разливают в стерильные пробирки 40 в объеме 1,0 мл. Для работы используют культуру со сплошным монослоем клеток, имеющих типичную морфологию для ФЭЧ, с четко выраженными границами между клетками. 8 качестве поддерживающей сре- 45 ды .используют приведенные питательные среды беэ добавления сыворотки.

Накопление инфекционного вируса в культуре клеток ФЭЧ. Для этой цели используют маточный материал полученного вари- 50 анта вируса Коксаки 82 (депонент

ГKB)1934). Доза заражения ооатааила 0;1 нл х

x10 ЦПД5о/мл на 250000-500000 клеток. За 2-3 ч до внесения вируса производят смену среды выращенной культуры ФЭЧ на 55 поддерживающую, но с добавлением трипсина в конечной концейтрации 50 мкгlмл.

Вирус вносят е культуру клеток ФЭЧ и после часового контакта культуру заливают средой. содержащей трипсин в такой же концентрации (50 мкг/мл), и инкубируют при

37 С в течение 2-7 дней до наступления характерных деструктивных изменений клеток. Просмотр зараженных вирусом клеток осуществляют на 2-3-й день после заражения. Степень цитопатогенного действия (ЦПД) вируса оценивают по четырехбалльной системе. Культуральную вируссодержащую жидкость получают посредством замораживания и оттаивания в смеси сухого льда со спиртом. Затем культуральную жидкость центрифугируют в течение 15 мин при

3000 об/мин, надосадочную жидкость сливают и используют в качестве инфекционного вируса. Количественное содержание вируса в надосадочной жидкости определяют методом конечного разведения е ФЭЧ с добавлением в питательную среду

50 мкгlмл трипсина. Инфекционный титр составляет 7.0 Ig ЦПД5о/0,1 мл.

Для реакции нейтрализации используют культуру ФЭЧ, выращенную на среде с

0,5 гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса, рН 7,0, с 10 -ным содержанием сыворотки крупного рогатого скота. Перед употреблением культуры ростовую среду меняют на поддерживающую (среду 199 беэ добавления сыворотки). Разведения вируса и исследуемые сыворотки готовят на среде

199. При этом число рядов стерильных пробирок должно соответствовать количеству исследуемых сывороток, а количество пробирок в одном ряду — числу разведения сывороток..Вируссодержащий материал в объеме 0,5 мл с активностью 100 ЦПД5о в

0,1 мл смешивают с 0,5 мл каждого разведе- . ния сыворотки, выдерживают смеси 1 ч при

37 С и вносят по 0,2 мл е 4 пробирки с культурой ФЭЧ, где предварительно производят смену ростовой среды на поддерживающую с добавлением е последние 50 мкг трипсина, После заражения пробирок смесями рабочую суспензию вируса разводят в

101, 102 и 10 раз и по 0,1 мл каждого разведения вводят в 4 пробирки, Культуру инкубируют при 37 С; результаты регистрируют на 7-е сутки после заражения. При окончательном учете результатов ЦПД в контроле при использовании вируса в рабочей дозе должно соответствовать 100

ЦПДю. Определение количественного содержания вируса B рабочей дозе в ФЭЧ также проводят в присутствии трипсина в поддерживающей среде..

Титром сыворотки считают наибольшее разведение, защищающее 50,0 зараженных культур от действия 100 ЦПДьо вируса.

" По сравнению с прототипом точность диагностики возрастает на 19.7 (выявляемость при .использовании предлагаемого

1714509

Составитель В.Литовченко

Редактор О,Юрковецкая . Техред М,Моргентал Корректор Т.Палий

Заказ 689 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

1.13035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 способа составляет 64,3, а в прототипе

44,6 ) и ри локализации инфекции в оболочках головного мозга (серозный менингйт), на 23 (выявляемость при использовании предлагаемого способа составляет 74.3, а в прототипе 51,32 ) при диагностике другой локализации инфекции, к примеру как сопутствующая при герпангине.

Формула изобретения

Способ серодиагностики Коксаки 8 инфекции, включающий забор крови, выделение сыворотки, ее разведение, инкубацию с тест-вирусом, выявление титра антител в культуре клеток и при нарастании титра антител в.парных сыворотках диагностируют

5 Коксаки Винфекцию,,отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа. в качестве тест-вируса используют трипсинзависимый вариант Коксаки В2 (штамм ОЫо-1) вируса.