Способ извлечения антител к фосфолипидным антигенам из крови

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к извлечению антител к фосфолитидным антигенам из крови. Цель изобретения - повышение специфичности удаления антител и упрощение способа. Кровь пропускают через сорбент, состоящий из полиакриламидных гранул с магнитными свойствами и с сорбированным к их поверхности комплексным кардиолипиновым антигенам. По сравнению с прототипом обеспечивается извлечение из крови только антител к фосфолитидным антигенам и достигается упрощение за счет одноэтапности извлечения антител.

Изобретение относится к области медицины, а именно к экстракорпоральным методам извлечения специфических антител из крови и других биологических жидкостей, и может использоваться в ревматологии, акушерстве и гинекологии, биотехнологии. Целью изобретения является повышение специфичности удаления антител к фосфолипидным антигенам и упрощение способа. Способ осуществляют следующим образом. Кровь пропускают через иммуносорбент. В качестве иммуносорбента используют полиакриламидные гранулы с магнитными свойствами с иммобилизованным на них методом физической адсорбции фосфолипидным антигеном. В качестве фосфолипидного антигена используют коммерческий кардиолипиновый антиген, выпускаемый Харьковским предприятием по производству бактериальных препаратов. Предложенный способ поясняют следующими примерами. П р и м е р 1. Сорбция специфических антител к кардиолипиновому антигену из крови женщин с хроническим невынашиванием беременности. Для очистки крови используют полиакриламидные гранулы с магнитными свойствами с иммобилизованным кардиолипиновым антигеном. Для этих целей 1 г полиакриламидных гранул вносили в колонку вместимостью 5 мл и перфузировали через нее 8 мл гепаринизированной крови женщин, страдающих невынашиванием беременности, в крови которых циркулируют антитела к фосфолипидным антигенам, со скоростью 8 мл/ч в течение 1 ч при температуре 37^oC. Гранулы отмывали от несвязавшегося белка 0,1М фосфатным буферным раствором рН 7,4, содержащим 0,15М хлорид натрия со спектрофотометрическим контролем до значений экстинции 0,05 (при длине волны 280 нм). Элюцию проводили 0,1М глицин HCl буфером, рН 2,8 дважды по 10 мин (4^oC). Элюат нейтрализовали 1М K₂HPO₄, диализовали в течение 16 ч при 4^oC против 5 л 0,15М раствора NaCl и концентрировали до исходного объема. В сыворотке крови до и после сорбции измеряли концентрацию антител к кардиолипиновому антигену непрямым твердофазным иммуноферментным методом (Е 1 А). В крови до и после сорбции измеряли содержание форменных элементов крови (эритроцитов, лейкоцитов, тромбоцитов). В элюате определяли общий белок по Лоури. По описанной методике проведена сорбция антител из крови 10 женщин, страдающих хроническим невынашиванием беременности. В качестве контроля использовали сыворотки крови 10 практически здоровых лиц, у которых измеряли концентрацию антител к кардиолипиновому антигену по вышеуказанной методике. Концентрация антител до сорбции была достоверно выше у приблизительно в 3 раза больных, чем у доноров (Р < 0,001). После сорбции происходило ее снижение до уровня здоровых лиц (р < 0,05). При этом не происходит снижения форменных элементов крови, характерного для общепринятых сорбционных методов. П р и м е р 2. Сорбция антител к кардиолипиновому антигену из плазмы крови больных системной красной волчанкой (СКВ). В колонку вносят 1 г полученных гранул и перфузируют через нее 8 мл плазмы крови больных СКВ, содержащих антитела к кардиолипиновому антигену со скоростью 8 мл/ч в течение 1 ч. Далее сорбент отмывают от несвязавшихся белков 0,1М фосфатным буферным раствором рН 7,4, содержащим 0,15 М хлорид натрия со спектрофотометрическим контролем на длине волны 280 нм до значений экстинции 0,05. Элюцию проводили 0,1М глицин HCl буфером рН 2,8 два раза по 10 мин. Элюат нейтрализовали 1М K₂HPO₄, диализовали против 0,15 М раствора NaCl и концентрировали до исходного объема. В сыворотке крови до и после сорбции измеряли концентрацию антител к кардиолипиновому антигену непрямым твердофазным иммуноферментным методом (Е 1 А). В элюате определяли общий белок по Лоури. По описанной методике проведена сорбция антител из плазмы крови 10 больных СКВ, имеющих симптомы антифосфолипидного синдрома. В качестве контроля использовали сыворотку крови 10 практически здоровых лиц, у которых измеряли концентрацию антикардиолипиновых антител по вышеуказанной методике. После сорбции происходило достоверное снижение концентрации антител (р < 0,001) до уровня доноров (р < 0,05). П р и м е р 3. Регенерация и повторное использование гранул. После сорбции гранулы регенерировали 0,1М глицин HCl буфером рН 2,8 или 3М раствором роданида калия (KCNS). После первой регенерации потеря активности составила 11% при последующей регенерации потери активности не происходило. Учитывая низкую неспецифическую емкость сорбента, можно считать, что все они являются антителами к кардиолипиновому антигену. Таким образом, концентрация вышеупомянутых антител в плазме крови равна 3,94 мг: 8 мл 0,49 мг/мл. Содержание общего белка в плазме колеблется от 60 до 80 мг/мл (в среднем 70 мг/мл), значит, антикардиолипиновые антитела составляют (0,49 мг/мл: 70 мг/мл)·100% 0,7% от его общего количества. При плазмофорезе для извлечения этой крайне незначительной доли антител удаляют всю плазму. При этом остальные 99,3% нормальных белков безвозвратно теряются. Предложенный способ позволяет удалять вышеуказанные антитела с высокой специфичностью, близкой к 100% и, таким образом, повышает селективность их извлечения в 100-150 раз (100%0,7% 143). Таким образом, предлагаемый сорбент инертен, имеет низкую неспецифическую сорбционную емкость, обладает эластичной поверхностью, сводящей к минимуму повреждения форменных элементов крови. Включение магнитного материала упрощает манипуляции с гранулами, а также позволяет поддерживать их во взвешенном состоянии в процессе сорбции, что снижает травматизацию форменных элементов крови и повышает площадь соприкосновения с биологическими жидкостями. Сорбент можно регенерировать и многократно использовать без снижения сорбционной емкости. Он может использоваться в экстракорпоральных методах извлечения специфических антител. Его высокая специфичность и малая травматичность позволят расширить показания к проведению процедуры и улучшить эффект от нее, что будет способствовать улучшению прогноза, снижению инвалидности и увеличению средней продолжительности жизни при заболеваниях протекающих с проявлениями антифосфолипидного синдрома. Применение метода позволит получить экономический эффект за счет уменьшения сроков госпитализации больных, возможности повторного использования гранул, экономии плазмозамещающих препаратов. Удаление антител осуществляется одноэтапно, а в прототипе требуется многоэтапная очистка.

Формула изобретения

Способ извлечения антител к фосфолипидным антигенам из крови путем обработки крови, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности удаления антител и упрощения способа, крови пропускают через сорбент, состоящий из полиакриламидных гранул с магнитными свойствами и с адсорбированным к их поверхности комплексным кардиолипиновым антигеном.

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 31-2000

Извещение опубликовано: 10.11.2000        

---