Способ определения гаптенов

 

Изобретение относится к био.хи.мии. Цель изобретения - упрощение способа и сокращение времени опреде,яения. После инкубации исследуемого образца, меченого гаптена, антисыворотки и суспензии клеток стафилококка aureus проводят центрифугирование . Про.мывают осадки, помещают пробирки с осадками в гамма-счетчик и измеряют количество импульсов. Способ позволяет определить стельность коров по концентрации прогестерона в молоке.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ÄÄSUÄÄ 1428384 А 1 (!) 4 А 61 К 39/385, G 01 Х 33/534

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ,,-, Н А BTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3923!11/28-14 (22) 01.07.85 (46) 07.10.88. Бюл. ¹ 37 (71) Институт биоорганической химии

АН БССР (72) В. М. Гузов, А. И. Петрашин, С. А. Усанов и В. Л. Чащин (53) 6! 5.36(088.8) (56) Jungers S et a!. J. 1аЬ. С11п, #ed, 1981, м. 98, № 1, р. 30 — 36. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГАПТГНОВ (57) Изобретение относится к биохимии.

Цель изобретения — упрощение способа и сокращение времени определения. После инкубации исследуемого образца, меченого гаптена, антисыворотки и суспензии клеток стафилококка аигеив проводят центрифугироьание. Промывают осадки, помещают пробирки с осадками в гамма-счетчик и измеряют количество импульсов. Способ позволяет определить стельность коров по концентрации прогестерона в молоке.

1428384

Форл(ула изобретения

Изобретение относится к медицинской биохимии, а именно к способу определе1!Ил гаптенов, и может быть использова!го при диагностике различных патологических и физиологических состояний организма человека и животных, а также В научных исследованиях и биотехнологических процессах (например, получение стероидов с помощью ферментативных реакторов) при определении микроколичеств биологически активных веществ В жидкостях, не содержащих значительных количеств иммуноглобулинов группы 6.

I )е.!ь изобретения — упрощение определения г3111 åtl3 и сокращение вр(. мени анализа.

/1ри.)!ер /. Определение количества StaufcIIs, необходимого длл Выполнения радиоим )!уно.1оги !еского анализа 11pol ecfcpoHd.

Все определения дублируютсл. ,Л)об !!3 IHIOT в пробирки растворы peareil.1 ОВ1 бх:фер Л (0,15М 31!(.1, 1 чМ:-)ДТЛ, 50 мМ фо()ф Ilail 1 бу ф(- р. (),()- ) 1 з pl (), !, м л; ),J - f l p () I (. (l (j )() I i I i. I ну.(е13ой схандарт (бу(1>(. р:X Il.)н 1!е содер>K31I(ce прогестерона H()p()lil, м(>.)ок(>, разведенное дисти1;IH poli;1 fill()ii В(>;!Ой 13 c()o гно-! пении 1:5) O, l мл; !f1!3(f If)op(>i.i(;I кролнHfl 11P() Г!! )3 K(HI ьюг IT!! II P() I c(Г(1)() ll!! Ahf l II If (! Изорот() )ный альбумин (ВСА) В разве(efill!i, IIeo()x() (имом д,!я сВязыв;1ния 40---()() 3) !

3И()сих!О! О .)-прогестерона, 0,1 мл; суспс!1:IH)1 клеток S(. aureus и буфере В

t0 Зов ТВИН-20, 0,4g) холат, О,! 5 М . х!!С), ! мМ ЭДТА, 50 мМ фосфатll»!i! буфер, 002ф NaNI, pH 74), содержа!цал 0001;

0,005; 0,01; 0,005; 0,5; 0,75; 1 или 5 мг бактериальных клеток в О,! мл, 0,1 мл.

В пробирки для определения неспецифического связывания вместо антис!3)воротки добавляют буфер А.

Содержимое всех пробирок тщательно перемешивают, и пробирки инкубцруют 4 ч при комнатной температуре. После инкубации пробирки центрифугируют 15 мин 2000 g, промывают осадки один раз 0,5 ыл буфера В.

Все пробирки с осадками помещают в гамМ 3- С !ЕТЧИК И ИЗМЕРЯЮТ КОЛИЧЕСТВО ИМПУ)! Ьсов в каждой пробирке в течение 1 мин.

Рассчитывают среднее арифметическое значение (х) количества импульсов для каждой пары пробирок.

Определяют величину В/Т 100О для каждой дозы иммуносорбента, где  — связанная радиоактивность, имп/мин; Т вЂ” общая радиоактивность, имп/мин.

В линейных координатах строят график зависимости В/Т 100О от количества добавленных клеток St. aureus. По этому графику определяют количество клеток St. aureus, достаточное для полного отделения связанного антителами и свободного гаптена (0,5 мл). Присутствие в среде инкубации молока не влияет на эффективность отде5

)О

55 ления комплекса гаптена — антитело от свободного гаптена.

При,)!ер 2. Определение времени инкубации, необходимого для выполнения анализа.

Все определения дублируются.

Добавляют в пробирки растворы реагентов, как в примере 1, но добавляют во все пробирки по 0,1 мл суспензии с концентрацией 0,5 мг клеток (О,l мл), а в качестве нулевого стандарта используют коровье молоко, разбавленное дистиллированной водой в соотношении 1:5. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и пробирки инкубируют 0,5; l; 1,5; 2; 2,5; 3; 3,5; 4;

4,5; 5 ч при комнатной температуре, после чего обрабатывают, как в примере 1.

В линейных координатах строят график зависимости В/Т .100(> от времени инкубации. Равновесие в системе наступает через

4 ч.

/1рил!ер 3. Построение стандартной криВой. Все определения дублируются.

В пробирки добавля)от растворы рсаI cIIToI3, как в примере 2, но добавляют не только и растворы стан;!3рТоВ прогестерона, содержащие 1,6; 6,3;

12,3; 25; 50 нг прогестерона в мл.

)lосле инкубации в течение 4 ч пробирки обрабатывают, как В примерах 1 и 2. Определл!От всличи!!у В/В() 100Я для каждого стalf,(арт;1, где В связанная радиоак(п!3по(ть В прооирках, содержащих стан(1;1 pTll hie Ko,1è ÷ecTH3 и рогсстерОна, H )f fl /м ил;

В(, - - связанная радиоактивность В пробиркахх, o;I ePiK!i fili! x if y,1 130Й cT313 13PT, If )I ff/л!иH ..

В линейных координатах строят стандартную криву!о, откладывая по оси координат значение E3/В(, 100Я, а по оси абцисс— концентрацию стандартов прогестерона в нг/мл.

В от !ичие от известного предлагаемый способ позволяет избежать предварительной длительной инкубации бактерий с антисывороткой и тем самым сократить время анализа на 1 сут. Поскольку реакция с антителом достигает равновесия, нет необходимости вводить стадию остановки реакции.

Одностадийность процедуры анализа уменьцгает вероятность ошибки оператора.

Предлагаемый способ позволяет определять концентрацию гаптенов в буферных растворах (например, в сыворотке крови после экстракции или при синтезе стероидов в ферментативных реакторах) и в молоке (например, при определении концентрации прогестерона в молоке с целью определения стельности у коров).

Способ определения гаптенов, включающий инкубирование исследуемого образца, меченого гаптена и специфических антител с разделением свободного и связанного гаптена с помощью клеток Staphylococcus au! eus, 1428384

Составители Г. Крюкова

Редактор Н. Яцола Техред И. Верес Корректор Г. Решетник

Заказ 5064/9 Тираж 655 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и сокращения времени определения, инкубирование исследуемого образца, меченого гаптена, специфических антител осущеставляют одновременно с клетками Staphylo

coccus iureus.