Способ определения нарушения целостности мембран эритроцитов при рентгеновском облучении
Использование: биохимия, клиническая гематология. Сущность изобретения: эритроциты после рентгеновского облучения отмывают и инкубируют в изотонической среде, содержащей 2 мМ АТФ и 2 мМ Мд , 50 мМ трис-HCI при рН 7,5 для определения АТФазы и 2 мМ АМФ, 30 мМ Мд2+, 145,0 мМ трис-HCI при рН 8,6 для определения 51- нуклеотидазы. Способ позволяет определить повреждение эритроцитов в первые сутки после облучения. Для исследования используются нативные эритроциты, не обработанные детергентами. Табл.1.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (я)5 G 01 N 33/49
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Ql 4 4 (21) 4775808/14 (22) 29.12.89 (46) 23.05.92. Бюл. М 19 (71) Институт зоологии АН КазССР (72) Т.В.Цветкова, И.А.Бушнева и Э.В.Цокур (53) 612.015 (088.8) (56) Михайлова В.Ф., Тараканова Н.П. Экспер. биология и медицина, 1980, N 9, с.
375-377. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НАРУШЕНИЯ ЦЕЛОСТНОСТИ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ РЕНТГEHQBCKOM
ОБЛУЧЕНИИ
Изобретение относится к биохимии и клинической гематологии и предназначено для определения нарушения целостности мембран эритроцитов.
Известен способ определения нарушений целостности мембран эритроцитов, заключающийся в том, что проба крови с антикоагуляHTQM гепарином инкубируется в термостате при 37 С 1 ч, затем выделяется фракция эритроцитов в объеме 0,5 мл, в нее добавляется детергент и наносится на поверхность 36%-ного раствора урографина, центрифугируется при 15000 д 20 мин. После этого отбирается верхняя зона, а также отдельно собирается осадок, растворяется в дистиллированной воде и измеряется оптическая плотность каждой фракции при
380 нм, По калибровочной кривой, полученной путем сопоставления количества эритроцитов после подсчета их в камере Горяева и соответствующей оптической плотности этих же проб после гемолиза, определяют количество образующих каждую зону. Способ позволяет определить нарушение целостности мембран эритроцитов только после Ы 1735777 А1 (57) Использование: биохимия, клиническая гематология. Сущность изобретения: эритроциты после рентгеновского облучения отмывают и инкубируют в изотонической среде, содержащей 2 мМ АТФ и 2 мМ Mg
50 мМ трис-HCI при рН 7,5 для определения
АТФазы и 2 MM АМФ, 30 мМ Mg 145,0 мМ трис-HCI при рН 8,6 для определения 51нуклеотидазы. Способ позволяет определить повреждение эритроцитов в первые сутки после облучения. Для исследования используются нативные эритроциты, не обработанные детергентами. Табл. 1. обработки клеток 0,3%-ным раствором детергентов {твин-80, тритон х-100 и др.).
Однако известный способ является трудоемким, требует наличие урографина, де- 2 тергентов и высокоскоростной центрифуги, Цель изобретения -упрощение способа за счет сокращения числа операций и процедур. (л) Способ осуществляется следующим образом.
Эритроциты крыс после общего рентгеновского облучения в дозе 7,6 г отмывают, инкубируют в изотонической среде 2 мМ
АТФ и 2 мМ Мд, 50 мМ трис-HCI при рН
7,5 для определения АТФ и 2 мМ АМФ, 30 мМ Mg, 145 MM трис-HCI при рН 8,6 для определения 5 -нуклеотидазы. Расчет активности ферментов проводят по выходу неорганического фосфата, выделенного 1 млн. клеток за 1 ч инкубации. Количественное определение неорганического фосфата проводят по общепринятому методу с помощью раствора молибдата аммония и хлористого олова, Окраска развивается при комнатной
1735777
40
Составитель С.Рыбалкин
Техред M,Ìîðãåíòàë Корректор Q,Êðàâöîsý
Редактор С.Патрушева
Заказ 1813 Тираж Подписное
ВНИИПИ Гос а осударственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5 роизводственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина 101
l температуре через 20 мин и в дальнейшем не изменяется.
Активность ферментов, локализованных на наружной мембране через 3 ч после облучения, резко увеличивается и составляет для 5 -нуклеотидазы 186% от исходного
1 уровня, а для АТФазы 196% соответственно. Результаты эксперимента приведены в таблице.
Пример. Выделенные и отмытые после облучения животных эритроциты помещают в субстратную среду, содержащую
2 мМ АТФ и 2 мМ Mg, 50 мМ трис-HCI npu рН 7,5 для определения АТФазы и 2 мМ
АМФ, 30 мМ Mg +, 145 мМ трис-НС! при рН
8,6 для определения 5 -нуклеотидазы, инку1 бируют в термостате при 37 С 1 ч, количество поврежденных эритроцитов через 3 ч
26,59 + 5,75 млн. клеток, а активность 51 нуклеотидазы, АТФ увеличивается и составляет 186% от исходного уровня, а активность АТФ вЂ” 196%,.
Для проверки степени корреляции целостности мембраны с активацией гидролиза АМФ и АТФ в первые часы после облучения нами применен E-токоферолацетат как средство, стабилизирующее мембраны. Для этого животным за 18 ч до облучения внутрибрюшинно вводят 1=токоферолацетат в дозе 30 мг на 100 г массы.
Количество поврежденных эритроцитов через 3 ч после облучения на фоне введения мало чем отличалось от такового при облучении и только 24 ч после облучения приближалось к уровню исходных величин у интантных животных (116,4% . 5,9%) от
5 контроля. Активность АТФ и 5 -нуклеотида1 зы составляет в эти сроки 157 и 91,2%, а через 24 ч 139,7 и 75%. Структурная целостность мембраны, модифицированная токофероацетатом, коррелирует с активностью
10 мембраносвязанных ферментов 5 -нуклео1 тидазной и АТФ.
Предлагаемый способ позволяет определить повреждение целостности мембран эритроцитов в ранние сроки после облуче15 ния в любой клинической лаборатории.
Способ более экономичен, не требует дорогостоящих реактивов и оборудования, а также более корректен, так как используются нативные эритроциты, не обработан20 ные детергентами.
Формула изобретения
Способ определения нарушения целостности мембран эритроцитов при рентгеновском облучении путем инкубации
25 эритроцитов и регистрации показателя проницаемости мембран, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, регистрируют активность 5 -нуклеотидазы и
АТФ-азы в эритроцитах, при увеличении ак30 тивности через 3 ч после облучения животного определяют нарушение целостности мембран эритроцитов,
