Способ определения супероксидного анион-радикала при фагоцитозе

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения супероксидного анион-радикала при фагоцитозе . Цель изобретения - повышение чувствительности , точности способа и сокращение времени анализа. У обследуемого берут кровь, выделяют лейкоциты, инкубируют в присутствии нитросинего тетразолия и опсонированными плазмой частицами зимозана при 38,5-39,0°С. Реакцию останавливают 5 М соляной кислотой , затем проводят центрифугирование и осадок экстрагируют смесью диметилсульфоксида и хлороформа, взятых в соотношении 2:1, при 55-59°С с последующим определением супероксидного анион-радикала спектрофотометрически. По сравнению с прототипом чувствительность способа возрастает на 55%, точность в 10 раз при сокращении времени анализа в 4 раза. Ј

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧ ЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4787159/14 (22) 29.01,90 (46) 23.05.92. Бюл, ¹ 19 (71) I-й Московский медицинский институт им. Сеченова И.M. (72) А.Х.Коган, B.È.Åðøoâ, Г.P.Àëåêïåðîâà, И.В.Хапугина и А.Н.Перминов (53) 615.2 (088.8) (56) Sehopf P.Е. et el. J. of Immunol. Methods, 1984, 67, р. 109 — 117, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СУПЕРОКСИДНОГО АНИОН-РАДИКАЛА ПРИ ФАГОЦИТОЗЕ (57) Изобретение относится к медицине и может быть использовано для определения супероксидного анион-радикала при фагоцитозе. Цель изобретения — повышение чувИзобретение относится к медицине, в частности к биохимии, и касается способа оценки интенсивности свободно-радикальных процессов в крови.

Цель изобретения — повышение чувствительности, точности способа и сокращение времени исследования.

Способ осуществляется следующим образом.

У донора берут 8 — 10 мл венозной крови (в пробирку с гепарином из расчета 10 мкл гепарина на 1 мл крови). Выделяютлейкоциты отстаиванием крдви в пробирке в течение 1 5 — 2 ч или центрифугированием ее при

500 об/мин 5-7 мин; при этом кровь расслаивается на три слоя: нижний эритроцитарный — красного цвета, средний лей коцитарный — в виде тонкой белесоватой пленки и верхний — плазменный; отсасывают средний слой (лейкоцитарный) и большую часть верхнего плазменного слоя и

„„5U „„1735784 А1 ствительности, точности способа и сокращение времени анализа. У обследуемого берут кровь, выделяют лейкоциты, инкубируют в присутствии нитросинего тетразолия и опсонированными, плазмой частицами зимозана при 38,5 — 39,0 С.

Реакцию останавливают 5 М соляной кислотой, затем проводят центрифугирование и осадок экстрагируют смесью диметилсульфоксида и хлороформа, взятых в соотношении 2:1, при 55-59 С с последующим определением супероксидного анион-радикала спектрофотометрически, По сравнению с прототипом чувствительность способа возрастает на 55%, точность в 10 раз при сокращении времени анализа в 4 раза. переносят в центрифужную пробирку; центрифугируют при 1000 об/мин 10 мин. Образовавшийся осадок — это лейкоциты.

Освобождают . лейкоциты от примеси эритроцитов посредством мягкого осмолизиса — добавлением 6 мл дистиллированной воды на 10 с и остановкой его восстановлением изоосмолярности добавлением 2 мл гипертонического (3,6%) раствора поваренной соли, Центрифугируют при 1000 об/мин, отбрасывают супернатант; осадок, состоящий из лейкоцитов, дважды отмывают 6 — 8 мл физиологического раствора (рН—

7,35), разводят полученную лейкоцитарную взвесь физиологическим раствором (рН—

7,35) до конечной концентрации лейкоцитов

Зх10 в 1 мкл. Затем 0,2 мл лейкоцитарной взвеси переносят в пробирку, добавляют 0,5 мл 0,2%-ного раствора нитросинего,тетраэония (Н СТ) и 0,2 мл раствора, содержащего опсонизированные плазмой частицы зимо1735784 раствора НСТ и 0,2 мл опсонизированного 30 зимозана (из расчета 70 — 100 частиц зимозана на 1 лейкоцит), Смесь инкубируют в термостате при температуре 38,5 С в течение

1,5 ч. После этого для остановки реакции добавляют 1 мл 5 М раствора соляной кис- 35 лоты. Сразу же дважды экстрагируют гранулы образовавшегося осадка формазанов— смесью ДМСО с хлороформом в соотношении 2:1 при 55 С, каждый раз по 15 мин.

Затем проводили спектрофотометрию каж- 40 дого экстракта при длине волны 560 нм. В

55 зана из расчета 70 — 100 частиц зимозана на

1 лейкоцит. Смесь инкубируют в термостате при температуре 38,5 — 39,0 С в течение 1—

1,5 ч. После этого добавляют в пробирку 1 мл 5 М раствора соляной кислоты (для остановки реакции), центрифугируют смесь при

3000 об/мин в течение 10 мин, супернатант удаляют. Осадок, состоящий из продуктов реакции взаимодействия супероксидного ариона — радикала (CAP) и НСТ вЂ” формазанов, экстрагируют 3 мл раствора, содержащего 2 мл диметилсульфоксида и 1 мл хлороформа в течение 15 мин при 55 — 59 С.

Затем повторно центрифугируют при 3000 об/мин в течение 10 мин и вновь проводят экстракцию, После этого проводят спектрофотометрию каждого экстракта при длине волны 560 нм. Контролем служит смесь диметилсульфоксида (ДМСО) и хлороформа в соотношении 2:1, Результаты измерений двух экстрактов суммируются: вместе они показывают концентрацию CAP по оптической плотности продуктов реакции взаимодействия CAP с НСТ-формазанов в единицах оптической плотности (ЕОП), Пример 1. У донора берут 8 — 10 мл крови (мужчина 21 года, группа крови О/1), К 0,2 мл взвеси лейкоцитов (концентрация

3000 в 1 мкл) добавляют 0,5 мл 0,2% íîãî качестве контроля использовали смесь

ДМСО с хлороформом в соотношении 2: I.

Данные спектрофотометрических измерений двух экстрактов суммировали. Суммарная величина показывала концентрацию

CAP по оптической плотности продуктов реакции CAP и НСТ-формазанов, Результат:

0,248 единиц оптической плотности; (0,193

+ 0,055 ВОП), общее время проведения исследования 3 ч.

Пример 2. Кровь того же донора, К 0,2 мл взвеси лейкоцитов (3000 в 1 мкл) добавили 0,5 мл 0,2%-ного раствора НСТ и 0,2 мл взвеси опсонированногоi зимозана (из расчета 70 — 100 частиц на 1 лейкоцит), Инкубировали смесь в термостате при температуре 39,0 С в течение 1,5 ч, Для остановки реакции добавили 1 мл 5 М раствора соля5

25 ной кислоты. Сразу же после этого образовавшийся осадок гранул формазанов (продукты реакции CAP и НСТ) дважды экстрагировали смесью ДМСО с хлороформом в соотношении 2;1 при 55 С, каждый раз по 15 мин. Затем проводили спектрофотометрию каждого экстракта при длине волны 560 нм, В качестве контроля использовалась смесь ДМСО с хлороформом в соотношении 2;1. Данные спектрофотометрий двух экстрактов суммировали.

Суммарная величина показы вала кон центрацию CAP по оптической плотности продуктов реакции CAP и НСТ-формазанов в

ЕОП, Результат 0,245 единиц оптической плотности; общее время проведения исследования 3 ч (0,205+ 0,040 ВОП).

В заключении следует отметить, что предлагаемый способ выгодно отличается от известного тем, что его выполнение требует в 4 раза меньше времени (около 3 ч), чем по известному (12 — 14 ч), повышает чувствительность в среднем на 55% (количество образующегося CAP по концентрации конечного продукта реакции CAP и НСТформазанов по предлагаемому способу составляет в среднем 0,245 ЕОП, а по известному 0,1575, уменьшает разброс результатов исследования (количество образующегося САР по концентрации формазанов у в 10 раз) по предлагаемому способу -0,2430,248 EOI=I, Л= 0,005; по известному 0,122—

0,172 ЕОП, Л = 0,05, повышает точность исследования (по предлагаемому способу средняя ошибка m равна 0,00084, по известному — 0,01284).

Формула изобретения

Способ определения супероксидного анион-радикала при фагоцитозе, включающий забор крови, выделение лейкоцитов, инкубацию их с опсонизированными частицами зимозана и нитросиним тетразолием, добавление соляной кислоты, экстракцию органическим растворителем и определение содержания супероксидного анион-радикала по оптической плотности экстракта с помощью спектрофотометра, о т л и ч а ю щ ий с я тем, что, с целью повышения чувств ител ьности, точности способа и сокращения времени анализа, лейкоциты инкубируют с опсонизированными частицами зимозана при 38,5 — 39,0 С, для остановки реакции используют 5 М раствор соляной кислоты, в качестве органического растворителя используют смесь диметилсул ьфоксида и хлороформа, взятых в соотношении 2:1, перед спектрофотометрией экстракцию растворителем проводят при 55 — 59 С.