Способ диагностики коклюша

 

Изобретение относится к области микробиологии и может бить использовано в медицине для диагностики коклюша . Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности способа диагностики коклюша. Цель достигается тем, что используют непрямой иммунофлюоресцентный метод для обнаружения коклюшного антигена в материале с задней стенки глотки, забираемом с помощью отдельного заднеглоточного тампона, увлажненного в 0,85%-ном растворе хлорида натрия с последующим добавлением к нему 0,15 мл дистиллированной воды и гащением исследуемого субстрата путем встряхивания в течение 1 мин со стеклянными бусами диаметром 6,0 мм, обычно используемыми для дефибринирования крови. Предлагаемый способ превосходит по чувствительности и специфично сти известный способ определения коклюшного антигена с помощью прямой реакции иммунофлюоресценции: уменьшает количество ложноположительных результатов за счет выявления неспецифических реакций на контрольных препаратах , повышает чувствительность метода за счет использования для обтряхивания тампона крупных Л еклянных бус диаметром 6,0 мм. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (51)5 G 01 N 33/533

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОсудАРстВейный ИОмитет

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГННТ СССР

1 (21) 4736011/14 (22) 27.06.89 (46) 07.05,92. Бюл. Р 17 (71) Казанский государственный медицинский институт им. С.В.Курашова (72) Н.Ф.Амфитеатрова и А.Н.Савинова (53) 615.373 (088.8) (56) Scandinavian I. .Infесtions Diseases, 1 984, V. 16, р; 281. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КОКЛЮША (57) Изобретение относится к области микробиологии и мох<ет бь1ть использовано в медицине для диагностики коклюша. Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности способа диагностики коклюша. Цель достигается тем, что используют непрямой иммунофлюоресцентный метод для обнаружения коклюшного антигена в материале с задней стенки глотки, Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано в медицине для диагностики коклюша.

Целью изобретения является повышение чувствительности и специфичности . способа обнаружения коклюшного антигена в материале из зева обследуемого.

Способ осуществляется следующим образом.

Забор материала из зева обследуемого производят заднеглоточным тампоном, укрепленным на металлической

„,Я0„„17322 8 А 1 забираемом с помощью отдельного заднеглоточного тампона, увлажненного в

0,85%-ном растворе хлорида натрия с последующим добавлением к нему

0,15 мл дистиллированной воды и гащением исследуемого субстрата путем встряхивания в течение 1 мин со стеклянными бусами диаметром 6,0 мм, обычно используемыми для дефибринирования крови. Предлагаемый способ превосходит по чувствительности и специфично сти известный способ определения коклюшного антигена с помощью прямой реакции иммунофлюоресценции: уменьшает количество ложноположительных результатов за счет ыявления неспецифических реакций на контрольных пре- Е паратах, повышает чувствительность метода за счет использования для обтряхивания тампона крупных. дуклянI ных бус диаметром 6,0 мм. проволоке, изогнутой под углом 120<, увлах<ненным стерильным физиологическим раствором (0,85Z раствора хлорида натрия). Данный тампон не.используют для посева на питательную среду. В пробирку с тампоном добавляют 3-4 стеклянные бусинки диаметром 6,0 мм„ предназначенные для дефибринирования крови и 0,15 мл стерильной дистиллированной воды,- содержимое пробирки встряхивают вручную в течение 1 мин.

Готовят три препарата: один опытный и два для контроля иммунологической специфичности, используемые в качест3

173 ве отрицательного и положительного контролей. Для приготовления двух первых препаратов (опытного и отрицательного контрольного) на два обезжиренных предметных стекла наносят по одной капле исследуемого субстрата пастеровской пипеткой из пробирки с тампоном. Для приготовления мазка, используемого в качестве положитель-. ного контроля, на обезжиренное предметное стекло наносят каплю физиологического раствора и петлей наносят культуру В.pertussis. После подсушивания на воздухе все три препарата фиксируют в течение 20 мин в этиловом спирте, охлажденном в морозильной камере холодильника. Мазки на высохших стеклах обводятся с обратной стороны препарата карандашом по стеклу для облегчения последующего просмотра

% под микроскопом. Затем препараты по- мещаются во влажную камеру и на них наслаивают кроличью коклюшную гипериммунную агглютинируюцую сыворотку с титром не ниже 1:25600 и разведении

1:100, отцентрифугированную при

3000 об/мин в течение 10 мин. Все разведения сывороток производят в забуференном физиологическом растворе (состав: NaC1 8,65. г; Na HP04, 1,92 г;

КН РО 0,44 г; дистиллированной воды

1000 мл; рН = 7,2-7,4); автоклавируют 30 мин при 0,5 атм. В качестве влажной камеры можно использовать стерилизатор с небольшим количеством те»»лового физиологического раствора на дне, помещая стекла на перевернутую вверх дном сетку стерилизатора. С . закрытой крышкой стерилизатор ставят в термостат при 37ОС на 15 мин. Затем препараты тщательно промываются поочередно в двух стаканах с буферным физиологическим раствором »IO 5 MHH c помощью пинцета и подсушиваются на воздухе в вертикальном положении на фильтровальной бумаге. На два препарата (опытный и положительнь»й контроль) наливают люминесцирующую съ»воротку против глобулинов.кролика в разведении 1:10, а на препарат, используемый в качестве отрицательного контроля, наслаивают люминесцирующую сыворотку против глобулинов.лошади в разведении 1:10 производства того же института. (Люминесцирующие сувороткй в рабочем разведении необходимо центрифугировать при 3000 об/мин в тече- ние 10 мин). Далее все препараты выt

2278 4 держивают во влажной камере при 37 С

6 в течение 15 мин, после чего аккуратно промывают дважды в свежем буферном физиологическом растворе по 5 мин с помоцью пинцета, сушат,на воздухе в вертикальном положении и просматривают под люминесцентным микроскопом. Микроскопию проводят в подающем свете с использованием фильтров ФС 1-2, BC

<8-2, СЗС 7-2. Запирающий фильтр Т-2-Н, 50 коммерческой лю»»инесцирующей сыворотки против глобулинов осла (использо валась экспериментальная серия »1роизводства того же института). Ппя постановки непрямого иммунофлю5 . оресцентного метода при диагностике коклюша.

Непрямой иммунофлюоресцентный метод также может быть использован для

Э идентификации выделенных культур, IS

40 объектив 90х, окуляр 10х, сила тока пр»» микроскоп»»и 4,5-5 А. Для микроскопии применяется нефлюоресцирующее иммерсионное масло П = 1,516. Для оценки интенсивности свечения используется четырехкрестовая система: ++++ очень яркая лн»»инесценция по периферии клетки, +++ яркая люминесценция периферии клетки, ++ или + слабое

I свечения периферии клетки; — люминесценция клеток отсутствует. Положительным результатом считается люминесценция клеток, оцениваемая на + + и +++. Такое свечение должно быть в препарате, используемом в качестве положительного контроля. В препарате, используемом в качестве отрицательного контроля, специфическое свечение не должно наблюдаться.

Опытньп» препарат необходимо просмотреть не менее, чем в 50 полях зрения и при наличии 3-4 и более специфически светящихся клеток, результат считать положительным. При обнаружении аналогично светящихся микробных клеток/в препарате, используемом в качестве отрицательного контроля, результат считается отрицательным.

Остальные контроли необходимо ставить при использовании новых серий гипериммунной и люминесцирующей сывороток.

Исследования показапи возможность использования в качестве коклюшной гипериммунной агглютинирующей сыворотки ко»»мерческой коклюшной агглютинирующей сыворотки, полученной пу-:. тем иммунизации ослов при наличии Ф

5.

173 что особенно важно при исследовании атипичных штампов.

При разработке предлагаемого мето-,. да проводили сравнительные исследования по отбору жидкости, применяемой для смачивания тампонов при заборе материала с задней стенки глотки. Исследовались следующие жидкости: физиологический раствор (0,857 раствор хлористого натрия), физиологический раствор, забуренный фосфатами, смесь

Кузнецова, применяемая для увлажнения тампонов при обследовании на коклюш, содержащая кроме физиологического раствора активированный уголь, агарагар и фосфатный буфер.

Было показано, что использование для смачивания тампона физиологического раствора одновременно с обтряхиванием тампона стеклянными бусами диаметром 6,0 мм обеспечивает получение сверхсуммарного результата.

Известный метод смачивания тампонов питательной средой не использовался. Питательная среда, например с сыворотка крови, используется при бактериологическом исследовании для смачивания .тампона в качестве транспортной среды, рассчитанной на сохранение жизнеспособности микробов и, подращивание их в процессе транспортировки в течение нескольких часов.

При исследовании НИФ-методом смачивание тампона физиологическим раствором применялось лишь для улучшения

его адсорбционных свойств, а не как питательная среда для микробов, так как неважно, живой или погибший микроорганизм будет в дальнейшем реаги-. ровать с иммунной сывороткой.

Проводилось также сравнительное исследование по подбору оптимального количества дистиллированной воды, s которой встряхивался тампон с бусами.

Расчет добавляемой дистиллированной воды делался не из объема, необходимого для смачивания ватного тампона (так как тампон, предварительно увлажненный физиологическим раствором перед забором материала, больше жидкости не впитывал), а определялся минимальной величиной, которая бы обеспечивала наибольшую концентрацию микробов в единице объема и почти полностью использовалась при приготовлении препаратов. Исследовались три объема: 0„5 мм, 0,25 мм и О, 15 мл.

Так как для.приготовления препаратов.

2278 использовались две крупные капли, при исследовании первых двух объемов большая часть взвеси оставалась неиспользованной. Это понижало шансы на обнаружение возбудителя коклюша. К тому же и концентрация микробов в этих ,вэвесях была меньше. При обтряхиванин тампона в 0,15 мл дистиллированной

1р воды весь объем исследуемой жидкости полностью использовался для приготов ления препарата.

Для повышения чувствительности метода большое значение имеет способ

15 обтряхивания тампона, содержащего исследуемый материал. Пооволились исследования по использованию для обтряхивания тампона в О, 15 мл дистиллированной воды мелких стеклянных бус диаметром 3,0 мм, а также крупных стеклянных бус с диаметром 6,0 мм, которые .обычно применяются только для дефибринирования крови, а для обтряхивания тампонов никем не применялись.

Для контроля исследовалось обтряхивание тампона без бус. Исследовались взвеси коклюшных бактерий в концентрациях 107 106 10 и 10 микробных клеток в 1 мл.

30 Было показано, что использование мелких стеклянньм бус при встряхивании не обеспечивает эффекта выколачивания микробов, так как масса бусинок, а следовательно, и их ударная сила очень мала. Тогда как стеклянные бусы с диаметром 6,0 мм обеспечивают более высокую концентрацию микробов s исследуемой жидкости и потому существенно повышают чувствительность и

40 точность метода.

Предлагаемый способ превосходит известный но чувствительности за счет .использования непрямой реакции имму- ° нофлюоресценции вместо прямой, при45 менения отдельного тампона, Ъе ис- s, пользованного предварительно для производства бактериологического посева, увлажнения тампона перед забором материала, что улучшает условия забора, 50 сохранность материала при транспортировке в лабораторию, использования; при встряхивании крупных стеклянных бус с диаметром 6,0 мм, значительно увеличивающих концентрацию микробов

55 в исследуемом субстрате по сравнению с известным способом и унифирует ус ловия обогащения исследуемого субстрата при встряхивании, так как прилиЦ ваемая дистиллированная вода не впи-:

1732278 хывается увлажненным таипонои. Пред- ° ! лагаемый способ превосходит известный и по специфичности, поскольку он уменьшает коли"- ество ложноположительных реакций за счет выявления неспецифического свечения в контрольных . препаратах.

П р и.м е р 1. Непрямым иммунофлюоресцентным методом обследовано

135 детей, из них 48 с подозрением на коклюш, 39 — контактировавших с больными коклюшем, 4 ребенка с подтвер>хденным диагнозом ОРЗ коккавой этиологии и 44 здоровых ребенка. !

Для выявления чувствительности

НИФ-метода все дети с подозрением на коклюш и контактировавшие с больными коклюшем подвергались также бактериологическому и серологическому иссле- 20 дованияи. НИФ-метод был положителен у 54 детей из 87. Все случаи положительных результатов при НИФ исследовании подтверждены серологическим методом, а 12 — еще и бактериологи- 25 ческии.

Здоровые дети и больные ОРЗ помимо НИФ метода также исследовались бактериологическим методом. Результаты исследований у всех детей были отрицательными.

Таким образом, НИФ метод чувствительнее бактериологического. Кроме того, on обладает рядом преимуществ по сравнению с серологическим мето35 дом: позволяет избежать негативных моментов, связанных с двукратным за-.

I бором крови для реакции агглютинации, дает возможность выявления коклюшного антигена в течение всего срока забо- 4

I левания, начиная с первых дней, результат НИФ может. быть получен в течение нескольких часов.

Доказано, что исследуемые штаммы

B.pertussis дают яркое специфическое свечение в опытных препаратах и не дают свечения или светятся на + в контрольных препаратах. Специфическое (иногда неспецифическое, но яркое) свечение на ++++ и на +++ в опытных препаратах дают также 40% исследованных LfTBMMQB S.aureus,oäíàêo все они светятся и в контрольных препаратах на ++++, +++ или ++, т.е легко отличаются от В.регtussis, штаммы которого в контрольных препаратах либо не дают свечения, либо светятся на +.

Кроме того, светящиеся стафилококки легко отличить от коклюшных палочек

Ю по морфологии и по неспецифическому (всей поверхностью микробной клетки) свечению.

Формула изобретения

Способ диагностики коклюша путем забора исследуемого материала из зева обследуемого носоглоточным тампоном, помещения его в дистиллированную воду со стеклянными бусами и встряхивания. с последующим исследованием приготовленных проб жидкости в реакции иимунофлюоресценции, о т л и— ч а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности и специ-фичности способа; перед забором материала таипон увлажняют в 0 85%-ном растворе хлорида натрия, встряхивание тампона проводят в 0 15 мл дистиллированной.воды в присутствии 3-4 стек— лянных бус диаметром 6 мм, а исследование проб жидкости осуществляют в непрямой реакции иммунофлуоресценции. -.Сставитель П. Бокарцев

Редактор В. Бугренкова Техред А. Кравчук Корректор. С.11екмар

Заказ 1580 Тираж Р Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4!5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãîðîä, ул. Гагарина,101