Способ выделения из воды вирусов

 

Способ выделения из воды вирусов. Использование извлечение неопределимо малых количеств вирусов из больших объемов воды и их концентрирования до уровня чувствительности вирусологических методов. Сущность изобретения: анализируемую пробу пропускают через фильтр-адсорбент, представляющий собой пространственноглобулярную структуру из меламиноформальдегидной смолы с проницаемостью материала 1000 уд. об./ч. Сорбированный вирус элюируют буферным раствором, содержащим 0,5 - 1,0 моль М NaCI, 3,0 - 3,5% мясного экстракта и имеющим рН 7,5. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛ ИСТИЧ Е СКИХ

РЕСПУБЛИК (5!)5 С 12 Q 1/04

ГОСУДАР СТВЕ ННЫ Й КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4750613/13 (22) 18.10,89 (46) 23.06.92. Бюл. ¹ 23 (71) Ленинградский политехнический институт им. М,И, Калинина, Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов AMH СССР и

Государстве н н ы и науч но-исследовател ьский и проектный институт по обогащению . руд цветных металлов "Казмеханобр" (72) Г,А. Ширман, В.M. Коликов, В.А, Гиневская, В.А. Казанцева, Л.Е. Баева, О.Е. Иванова, Т,П. Еремеева, А.Б. Орешков, Н.В.

Катушкина, П.С. Григорьев и Н.Я, Любман (53) 578(088,8) (56) Красильников И.В„ Каранцева В,A., Иванова О,Е. и др. Выделение вирусов из воды с использованием пористых кремнеземов. Вопросы вирусол. 1985, .т. 30, ¹ 5, с.

608.

Raphael R.À„Sàttàã S.À., Sprlngthorper

V.S. RotavIrtjs concentration from raw water

Using pozitlvely charged filters // J. Virol.

Meth.- 1985, — ч. 11 — № 2 — р. 131-140.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для извлечения неопределимо малых количеств вирусов из больших объемов воды и их концентрирования до уровня чувствительности вирусологических методов при осуществлении контроля за степенью зараженности вирусами водных объектов окружающей среды, Известен метод выделения вирусов путем удаления воды из пробы через диализную мембрану с полиэтиленгликоль (гидроэкстракция), Однако этот метод можно использовать лишь при работе с малыми. объемами.

„„5U 1742333 Al (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ И3 ВОДЫ ВИРУСОВ (57) Способ выделения из воды вирусов. Использование: извлечение неопределимо малых количеств вирусов из больших объемов воды и их концентрирования до уровня чувствительности вирусологических методов.

Сущность изобретения: анализируемую пробу пропускают через фильтр-адсорбент, представляющий собой пространственноглобулярную структуру из меламиноформальдегидной смолы с проницаемостью материала 1000 уд. об./ч. Сорбированный вирус элюируют буферным раствором, содержащим 0,5 — 1,0 моль М NaCI, 3,0 — 3,5 мясного экстракта и имеющим рН 7,5, Известен способ выделения вируса гепатита А и энтеровирусов из больших объемов сточной и прирадной воды, включающий двухэтапное концентрирование вирусов методом сорбции на бетоните и ультрацентрифугирование элюата на заключительном этапе, Достоинством этого способа является малая зависимость его эффективности от степени загрязнения воды взвешенными веществами, Однако большая длительность и сложное аппаратурное оформление метода затрудняют его применение в лабораторной практике.

1742333

Известен способ выделения вирусов иэ воды с использованием пористых кремнеземов.

К недостаткам этого способа относятся невысокая скорость обработки воды и низкий фактор концентрирования, Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения вирусов из воды путем их сорбции на положительно заряженных фильтрах Zeta Plus 30S с последующей элюацией 3%-ным мясным экстрактом и рН 9,0, Этот способ имеет следующие недостатки, — низкий фактор концентрирования (2,5 — 4,5 раза) и малая эффективность открытия ((14,1 4,1)%), — достигнутого фактора концентрирования оказывается недостаточно для анализа и приходится прибегать к гидроэкстракции с полиэтиленгликолем, занимающей порядка 8 ч (ночь).

Цель изобретения заключается в повышении производительности процесса и увеличении фактора концентрирования вируса.

Поставленная цель достигается тем, что анализируемую воду пропускают через фильтр-адсорбент, представляющий собой пространственно-глобулярную структуру (ПГС) из меламиноформальдегидной смолы с проницаемостью материала 1000 уд.об,/ч. (Удельный объем (уд, об.) — безразмерная величина, численно равная объему пропущенного фильтрата, отнесенному к объему адсорбента. Проницаемость материала измерялась в уд. об,/ч и определялась, как количество уд, об., пропущенных за 1 ч через слой адсорбента толщиной 0,5 см при давлении 0,1 атм (1 м вод, ст.), Сорбированный вирус элюируют буферным раствором, содержащим 0,5 — 1,0 моль NaCI, 3,0 — 3,5% мясного экстракта и имеющим рН 7,5.

Сущность изобретения заключается в выборе адсорбента, обеспечивающего быстрое и эффективное выделение вирусов из воды, и в условиях десорбции вирусов, Структура адсорбента получается путем коагуляции полимерной фазы-в растворе в статических условиях в герметичной форме с последующей фиксацией двухфазной системы термообработки. Положительный эффект изобретения определяется большой внутренней поверхностью адсорбента, доступной для взаимодействия с- вирионами, и незначительным гидродинамическим сопротивлением материала адсорбента. При выборе оптимальных условий элюции вирусов учитывают необходимость устранения электростатических и гидрофобных взаимодействий, возникающих между вирусной частицей и внутренней поверхностью фильтра-адсорбента.

В качестве примеров рассматривают процессы выделения вирусов из воды.

Пример 1 (по прототипу). Ротавирус человека И подгруппы вносят в 250 мл воды, создавая концентрацию 1 3 10 1/мл. Пол4 ученную воду пропускают через фильтр Zeta

Plus 30$ (с размером пор 2 мкм) диаметром

47 мм. Во всех пробах фильтрата вирус не выявлялся, адсорбция вируса 100%. Для элюции вируса используют 3.%-ный мясной экстракт с рН 9,0, Отбирают 10 мл элюата.

Концентрация вируса в элюате (4,6 + 1,3) 10

1/мл, Таким образом, фактор концентрирования в данном случае составил всего 2,5—

4,5 раза, а эффективность открытия— (14,1 4,1)%. Из-за низкого фактора концентрирования приходится прибегать к гидроэкстракции с полиэтиленгликолем, занимающей порядка 8 ч (ночь).

Пример 2 (по предлагаемому способу). Ротавирус обезьян SA — Il осветляют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин и добавляют в воду, содержащую 0,005 моль MgClz, создавая концентрацию 118 АГед/мл (по данным иммуноферментного анализа. По 3 л такой воды пропускают через фильтр-адсорбент с проницаемостью материала 1000 уд. об./ч, выполненный в виде таблетки диаметром

1,7 см и толщиной 0,5 см (обьемом чуть более 1 мл с площадью поверхности 2,3 см ), Скорость пропускания воды 30 мл/мин (1700 уд,об./ч). Во всех пробах фильтрата вирус не выявлялся, адсорбция вируса

100%.

Для элюции вируса с фильтра-адсорбента используют девять различных буферных растворов, содержащих 0,05 моль трис-HCI;

0,5, 0,7 или 1,0 моль NaCI; 3,0, 3,2 или 3;5% мясного экстракта (Beef extract, Dlfco) и имеющих рН 7,5, Элюат отбирают по 15 — 20 мл. Определяя всякий раз концентрацию вируса в исходном образце и в элюате, вычисляют фактор концентрирования и эффективность открытия вируса. Результаты представлены в таблице.

В данном случае эффективность открытия менялась от опыта к опыту в диапазоне

60 — 70% (погрешность определения порядка 10%), а фактор концентрирования — в диапазоне 680 — 700 раз. Таким образом, можно говорить о слабой зависимости этих важных характеристик процесса выделения от концентрации NaCI и мясного экстракта в заявляемом диапазоне, Всякий раз операция выделения занимала 1 ч 45 мин.

1742333

Влияние элюента на процесс выделения вируса SA-I1 из воды с помощью ПГС-адсорбента из меламиноформальдегидной смолы

Составитель И.Агафонова

Техред М.Моргентал Корректор А. Осауленко

Редактор Т. Иванова

Заказ 2262 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва,.Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Пример 3 (по предлагаемому способу).

Вирус полиомелита типа l, штамм

LSc2ab осветляют центрифугированием при 2000 об/мин в течение 10 мин и добав- 5 ляют в воду, содержащую 0,005 моль Mg CI2, создавая концентрацию 8,3 10 <БОЕ /мл, определяемую титрованием на культуре клеток почек американских зеленых мартышек. 1 л такой воды пропускают через 10 фильтр-адсорбент, выполненный в виде таблетки диаметром 1,7 см и толщиной 0,5 см. Скорость пропускания воды 30 мл/мин (1700.уд.об./ч). Для элюции вируса с фильт-. ра-адсорбента используют буферный рас- 15 твор, как в примере 2.

B данном случае фактор концентрирования 168 раз, а эффективность открытия—

27,7%. Вся операция заняла 34 мин.

Использование предлагаемого способа 20 выделения из воды вирусов обеспечивает по сравнению с существующими способами следующие преимущества: — высокие скорости обработки воды, что существенно увеличивает производитель- .25 ность процесса (не менее чем. в 4 раза по сравнению с прототипом); — высокий фактор концентрирования вируса (до 700 раз, что в 150 раз больше по сравнению с концентрированием на фильтрах Zeta Plus).

Использование- изобретения возможно в лабораторной практике санитарно-эпидемиологических станций и подобных учреждений при осуществлении контроля за степенью зараженности вирусами водных объектов окружающей среды, Влияние элюента на процесс выделения вируса SA-(! из водйс помощью ПГС-адсорбента из меламиноформальдегидной смолы, Формула изобретения

Способ выделения из воды вирусов путем их сорбции на поверхности адсорбента с последующей элюцией, о т л и ч а ю щ и й-. с я тем, что, с целью повышения производительности и роцесса и степени концентрации вируса, в качестве адсорбента используют меламиноформальдегидную смолу с проницаемостью материала 1000 уд. об./ч,.а элюцию осуществляют буферным раствором рН 7,5, содержащим 0 5-1,0 моль NaO и 3,0 — 3,5 мясного экстракта.