Способ определения инсулиноподобных ростовых факторов i и ii в сыворотке крови человека

 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологическим методам определения инсулиноподобных ростовых факторов , и может быть использовано в клинической эндокринологии. Цель изобретения - сокращение времени определения. Использован твердофазный иммуноферментный анализ, включающий сорбцию специфических антител на полистироловом планшете, добавление испытуемой сыворотки , инкубацию с конъюгатом специфических антител с пероксидазой, внесение субстратной смеси и определение концентрации инсулиноподобных ростовых факторов по интенсивности окрашивания при длине волны 492 нм. fe

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (! 9) (11) (s1)s G 01 N 33/535

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ 3

1 (21) 4647201/14 (22) 13.12.88 (46) 30.06,92. Бюл. ¹ 24 (71) Центральный научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им.

И.И.Мечникова (72) И,Р.Васильева, В.Б,Гервазиева.

Л,К.Старосельцева и И.B.Åðmîâ (53) 615.375(088.8) (56) Furlanetto Н.W. — J.Clin. Invest., 1972, v, 60, р. 648-656. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНСУЛИНОПОДОБНЫХ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ 1 И II

В СЫBOPOTKE КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологическим методам определения ростовых факторов и может быть использовано в клинической эндокринологии.

Цель изобретения — сокращение времени определения гормона.

Указанная цель достигается тем, что используют планшет, который насыщают антителами к ИРФ I u II при рН 9,4, затем помещают на него испытуемую сыворотку и после инкубации и отмывки добавляют конъюгат антител к ИРФ I u II с пероксидазой хрена, инкубируют при 37, вновь отмывают, добавляют субстратную смесь, инкубируют в темноте, останавливают реакцию раствором серной кислоты и по интенсивности окрашивания определяют на спектрофотометре количество ИРФ 1 и 1!.

Предлагаемый способ иммуноферментного определения И РФ 1 и II позволяет безэкст2 ! (57) Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологическим методам определения инсулиноподобных ростовых факторов, и может быть использовано в клинической эндокринологии. Цель изобретения — сокращение времени определения.

Использован твердофазный иммуноферментный анализ, включающий сорбцию специфических антител на полистироловом планшете, добавление испытуемой сыворотки, инкубацию с конъюгатом специфических антител с пероксидазой, внесение субстратной смеси и определение концентрации инсулиноподобных ростовых факторов по интенсивности окрашивания при длине волны 492 нм. ракционным путем определять микроколичества и сократить время анализа.

Способ осуществляют следующим образом.

Иммуноферментная тест-система для определения ИРФ I и 1! основана на методе двойных антител с использованием твердофазного носителя. Источником антигена

ИРФ I и11служиттканьопухоли из j3-клеток островков Лангерганса — инсулинома. Для получения антигена из опухоли используют метод Васильевской И.В. Способ выделения и очистки ИРФ I и!!включает получение ацетонового порошка из ткани опухоли, экстракцию этанолом-HCI, осаждение спиртацетоновой смесью и гельфильтрацию в кислых условиях с NaCI. Получают гомогенный, высокоочищенный препарат, содержащий инсулиноподобные ростовые факторы I и II. Чистоту и гомогенность контролируют электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом по N-концевым амино1744651

20

30

50 кислотам дансильным методом, а также аминокислотным автоматическим анализатором.

Инсулиноподобные ростовые факторы I и ll представляют собой два низкомолекулярных пептида с M. в. = 7500 Дальтон.

Источником антител к ИРФ I è II ñëóæèò гаммаглобулиновая фракция моноспецифической сыворотки против человеческого препарата ИРФ I и !! из инсулиномы, Фракцию получали двукратным осаждением сульфатом аммония до 33 и 50% насыщения.На весь цикл иммунизации берут на одного кролика 8 мг высокоочищенного гомогенного антигена в 4 мл физиологического раствора и 4 мл полного адьюванта Фрейда, четыре инъекции делают с интервалом в 14 дней, I, II u tll инъекции проводят подкожно в 4 точки в области спины в нарастающих дозах: 0,25, 0,5 и 1,0 мл соответственно в каждую точку, а !Ч инъекцию — по 0,5 мл в подкожные лимфоузлы.

Для получения антител используют иммунную сыворотку с титром не менее 1:32, 1:64 в двойной радиальной иммунодиффузии по Оухтерлони. В иммуноферментном определении используют коньюгат антител к ИРФ !-!! с пероксидазой хрена в рабочем разведении 1;400. Субстратной смесью в тест-системе служит раствор 2,4-ортофенилендиамина (основной раствор: tO мг ортофенилендиамина в 1 мл метанола: рабочий раствор: 100 мкл основного раствора в 10 мл

0,05 M цитратного буфера, рН 4,7) с 33% перекисью водорода (2 мкл).

Для проведения иммуноферментного анализа в каждую лунку полистиролового планшета вносят по 0,2 мл антител к ИРФ и II в 0,01 М в карбонат-бикарбонатном буфере, рН 9,4, планшеты выдерживают 1 ч при 37 С, а затем 24 ч при 4 С. Далее планшеты обрабатывают 0.5%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина или манитолла в течение суток при 4 С, Планшеты многократно отмывают отмывающим раствором, состоящим из 0,1 M фосфатно-солевого, рН 7,4, буфера, 0,05%-ного Таина-20 и

0,1%-ного бычьего сывороточного альбумина, высушивают, плотно закрывают и хранят при 4 С.

В лунки первого ряда вносят по 0,2 мл отмывающего раствора, а в лунки lt u III рядов по 0,2 мл стандартного антигена в двукратных разведениях, в остальные лунки — в дублях исследуемые сыворотки. После инкубации в течение 24 ч при 37 С планшет вновь отмывают и в лунки вносят по 0,2 мл конъюгата в рабочем разведении. Планшеты выдерживают 24 ч при 37 С и после отмывки вносят раствор субстрата в объеме

0,2 мл, на 1 ч помещают в темноту, реакцию останавливают 0,05 мл 50%-ным раствором серной кислоты. Продукт реакции желтого цвета, его интенсивность оценивают по оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм. Количество антигена в исследуемых образцах, пропорциональное количеству связанного конъюгата, определяют по количеству гидролизованного субстрата. Содержание ИРФ и II в образцах определяют по калибровочной кривой, полученной при исследовании двукратных разведений стандартного антигена, Таким образом, предлагаемый способ иммуноферментного определения ИРФ и

ll в цельной сыворотке в течение 2 сут без предварительной трудоемкой обработки образца, позволяет использовать для его массовых обследований больных и в исследовательских целях.

Способ иллюстрируется следующим примером.

Иммуноферментное определение инсулиноподобных ростовых факторов I u II (ÈÐÔ ! и It) в сыворотке крови больной М. осуществляли следующим образом. Для определения ИРФ и !! использовали полистироловый планшет, насыщенный антителами к ИРФ I u II e концентрации 3 мкг/мл. В лунки первого ряда вносили по 0,2 мл отмывающего раствора, состоящего из

0,1 M фосфатно-солевого буфера, рН 7,4, 0,05%-ного Твина-20 и 0,1%-ного бычьего сывороточного альбумина. В лунки второго и третьего рядов вносили по 0,2 мл стандартного антигена в двукратных разведениях (в дублях) для построения калибровочного графика. Разведение стандарта начинали с концентрации 100 мкг/мл, В лунки четвертого ряда — 0,2 мл цельной сыворотки больной M.(в дубле). Планшет инкубировали 24 ч при 37 С. После инкубации планшет многократно отмывали отмывающим раствором, Затем во все лунки вносили по 0,2 мл коньюгата антител к ИРФ I u II с пероксидазой в разведении 1:400. Планшет выдерживали 24 ч при 37 С и отмывали аналогичным способом, В каждую лунку планшета вносили 0,2 мл субстратной смеси и помещали на 1 ч в темноту, реакцию останавливали 0,05 мл

50%-ным раствором серной кислоты. Продукт реакции был желтого цвета. его интенсивность оценивали по оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 492 нм, Содержание ИРФ I u II e сыворотке больной M определяли по калибровочному графику, где по оси абсцисс — концентра1744651 .

25

40

50

Составитель И.Башкаев

Техред М.Моргентал Корректор З.Салко

Редактор Ю,Середа

Заказ 2196 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101 ция стандартного антигена, по оси ординат. — оптическая плотность образцов (для удобства можно использовать полулогарифмические координатные оси, так как концентрация стандарта используется в до- 5 статочно широком диапазоне).

Величина ИРФ и II в сыворотке больной М. составила 34,8 мгк/мл. Больная M. наблюдается у зндокринолога по поводу акромегалии. 10

Таким образом, в течение 2 сут без специальной обработки в цельной сыворотке больной М. было определено содержание инсулиноподобных ростовых факторов! и !!.

Формула изобретения 15

Способ определения инсулиноподобных ростовых факторов и II в сыворотке крови человека с помощью специфической антисыворотки к инсулиноподобным ростовым факторам, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени проведения способа, используют иммуноферментный анализ путем нанесения специфических антител на полистироловый планшет при рН 9,4, инкубации в течение 1 ч при 37 С и в течение 18 ч при 4 С, добавления исследуемой сыворотки и выдерживания смеси в течение суток при 37 С, внесения антител к инсулиноподобным ростовым факторам, меченых пероксидазой хрена, и после контакта в течение 24 ч при

37ОС и добавления на 1 ч. раствора субстрата, пробу фотометрируют при длине волны

492 нм,