Способ получения рестриктазы, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов gtcgac

 

Использование: биотехнология, генная инженерия. Сущность изобретения: способ предусматривает использование в качестве штамма продуцета Rhizobium trifolii ВНИ- ИСХМ В-194, содержащего только одну рестриктазу, и использование для очистки фермента комбинации методов из фракцио нирования клеточных компонентов в двухфазной системе 7%-ный полиэтиленгликоль - 2%-ный декстран в присутствии 0,7 М NaCI и хроматографии на фосфоцеллюлозе Р-11 и гепарин-сефарозе с элюцией раствором NaCI в концентрации 0,5-0,7 М, что позволяет в 6-8 раз повысить выход целевого фермента и тем самым снизить себестоимость продукции. СО с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

"1 gc n (21) 4772065/13 (22) 22.12.89 (46) 07.08.92. Бюл. N 29 (71) Научно-исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ и Центральный

Сибирский ботанический сад СО АН СССР (72) И.С.Андреева, Г.Н.Афиногенова, Л.P.Ëåáåäåâ, Н.М,Пустошилова, Н.Я.Гордиенко и Г.Г.Майстренко (56) Roberts R.J. Restriction enzumes and

their isoshisomers. — Nvcl. Acids Res., 1987, ч. 15, р. 189 — 217.

Arrand J.R., Myers P.A„Roberts R.J. А пеw rеиrictiîп епdоnис! еàse from

Streptomyces albus G 2. — J. Mol. Biol., 1978, ч. 118, р. 127 — 135.

Maxwell А.and Halford S.Å. The Sal G 1

restriction endonuciease. — Biochem. J „-1982, v. 203, р, 77-84, Авторское свидетельство СССР

N. 767197, кл. С 12 N9/00,,1978, Изобретение относится к микробиологии и генной инженерии, в частности к получению эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GTCGAC.

Известен ряд способов получения рестриктаз, узнающих и расщепляющих в ДНК последовательность нуклеотидов GTCGAC, но большинство из них имеют небольшие выходы фермента ввиду низкой продуктивности штаммов микроорганизмов и трудоемкие процессы очистки ферментов, Известен способ получения эндонуклеазы рестрикции Sal Gl. способной узнавать Ы „„1752769 А1

tsi)s С 12 N 9/14 //(С 12 N 9/14, С 12 R 1:41) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕСТРИКТАЗЫ, СПОСОБНОЙ УЗНАВАТЬ И РАСЩЕПЛЯТЬ

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДОВ

GTCGAC (57) Использование: биотехнология, генная инженерия. Сущность изобретения: способ предусматривает использование в качестве штамма продуцета Rhizobium trifolii ВНИИСХМ В-194, содержащего только одну рестриктазу, и использование для очйстки фермента комбинации методов из фракционирования клеточных компонентов в двухфазной системе 7%-ный полиэтиленгликоль —. 2%-ный декстран в присутствии 0,7 M NaCI и хроматографий на фосфоцеллюлозе P-11 и гепарин-сефарозе с элюцией раствором

NaCl в концентрации 0.5-0,7 М, что позволяет в 6 — 8 раз повысить выход целевого фермента и тем самым снизить себестоимость продукции, и расщеплять последовательность нуклеотидов GTCGAC, Недостатком способа является трудоемкость, так как он включает четыре хроматографии (Био-гель А-0,5 m, ДЕАЕ-целлюлоза ДЕ-52, аминопентил се- фароза и фосфоцеллюлоза Р-11). Штамм содержит две рекстриктазы: Sal Gt u Sal Gll, что затрудняет процесс очистки. Выход фермента не указан.

Известен способ получения эндонуклеазы рестрикции Sal Gl путем также четырех хроматографий (фосфоцеллюлоза P-11, ДЕАЕ-сефадекс А-50, гепарин-агароза и гидроксилапатит).

1752769

Недостатками способа являются сложность процесса очистки, содержание в штамме двух рестриктаз Sal Gi u Sal GII.

Выход фермента по активности на конечном этапе составляет 0,8 от исходного.

Получаемый препарат рестриктазы Sal Gl нестабилен при хранении, Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату к предлагаемому является способ получения эндонуклеазы рестрикции Sai 61, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GTCGAC. Способ включает культивирование Streptomyces albvs G на среде Гаузе в течение 3 сут, сбор биомассы центрифугированием, дезинтеграцию клеток ультразвуком, центрифугирование и хроматографии на колонках с Био-гелем А0,5 m и гепарин-сефарозой с последующим дидл изом.

Недостатками способа являются использование в качестве штамма- продуцента S.aibus, содержащего две рестриктазы

SaI 6l u Sal GII, длительное культивирование, низкий выход целевого продукта (5000—

6400 ед.акт,/г биомассы) и небольшая концентрация последнего (2000 ед,акт./мл).

Целью изобретения является повыше. ние выхода целевого фермента, узнающего и расщепляющего последовательность нуклеотидов GTCGAC.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу в качестве штамма-про дуцента эндонуклеазы рестрикции, способной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GTCGAC, используют штамм Rhizobium trifolii, продуцирующий только одну рестриктазу Rtr I в повышенном количестве, в совокупности с методом очистки фермента путем фракционирования клеточных компонентов в двухфазной системе полиэтиленгликоль-декстран в присутствии 0,7 мол ь/л NaCI с последующими хроматографиями на фосфоцеллюлозе P11 и гепарин-сефарозе.

Используемый штамм Rhizobium trifolii депонирован в коллекции Всесоюзного научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии под номером В-194.

Наличие в штамме только одной рестриктазы с большим ее содержанием на 1 г клеток позволило применить для очистки фермента простой способ, сочетающий такие хорошо себя зарекомендовавшие стадии для очистки рестриктаз, как фракционирование клеточного экстракта в системе полиэтиленгликоль — декстран и две хроматографии на фосфоцеллюлозе Р-11 и гепарин-сефарозе.

В результате использования предлагаемого способа удается получить 40000 ед.акт. фермента из 1 г влажных клеток (около 12 исходного содержания фермента в грубом

5 экстракте), что в 6 — 8 раз больше, чем в известном способе, Полученная рестриктаза характеризуется следующими свойствами: узнает и гидролизует последовательность нуклеотидов GTCGAC, оптимальное значе10 ние рН для действия рестриктазы 8,0; оптимальная температура 37 С; для проявления активности рестриктазы требуются ионы

Mg2 (оптимальная концентрация Mg2 1015 мМ); оптимальная концентрация NaCI в

15 реакционной смеси 100-120 мМ.

Полученный ферментный препарат свободен от значительных количеств неспеци- фических нуклеаз и фосфатаз, При инкубации 200 ед.акт. фермента с 1 мкг ДНК

20 фага в течение 2 ч при 37 С наблюдается стандартный набор фрагментов ДНК, Фрагменты Д 1К, полученные при инкубации 10 ед.акт, фермента с 1 мкг ДНК фага в течение

2 ч при 37 С, сшиваются ДНК-лигазой и по25 вторно гидролиэуются рестриктазой Rtr I, .

Определяющими отличиями предлагаемого способа являются использование в качестве штамма-продуцента Rhizobium

trifolii, содержащего только одну рестрикта30 зу, и использование для очистки фермента комбинации методов из фракционирования клеточных компонентов в двухфазной сис.теме полиэтиленгликоль-декстран в присутствии 0,7 моль/л NaCI и хроматографий на

35 фосфоцеллюлозе P-11 и гепарин-сефарозе, что позволяет в 6-8 раз повысить выход целевого фермента по сравнению с известным способом, дает возможность получать более концентрированный ферментный

40 препарат (50000-80000 вместо 2000 ед,акт./мл в известном способе), Пример 1. Культивирование штамма

Rhizobium trifolii.

Культуру В trifoili выращивают на пита45 тельном бульоне следующего состава, г/л воды: пептон 10, дрожжевой экстракт 5; хпористый натрий 5;.глюкоза 10. Для получения;.—:. инокулята суточную культуру с плотной сре. ды засевают петлей в две колбы с 50 мл

50 питательного бульона в каждой. Выращивают в течение 24 ч на термостатированной качалке при.28-30 С со скоростью 200 — 250 об/мин. Затем полученным таким образом инокулятом засевают девять колб с 250 мл

55 питательного бульона в каждой и выращивают культуру в тех же условиях (24 ч при

28 — 30 С и 200 — 250 об/мин), Сбор биомассы проводят центрифугированием в течение 20 мин при 5000 об/мин. Конечный выход биомассы 6,0-6,5 ч/л.

1752769

Составитель Л.Юшкова.

Техред М.Моргентал Корректор Q.Юрковецкая

Редактор В.Петраш

Заказ 2734 . Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина. 101

Пример 2. Очистка фермента, 2 г клеток суспендируют в 4 мл буфера экстракции, содержащего 0,1 М трис-НО, рН 8,0, 0,1 M NaCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1%-ный тритон Х-100 и лизоцим 0,1 мг/мл до гомогенного состояния. Смесь инкубируют 30 мин при 0 С в ледяной бане и затем обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН-2 три раза по 20 с с перерывами по 40 с для охлаждения, К суспензии добавляют 10 мл раствора, содержащего 11,2%-ный полиэтиленгликоль ПЭГ-6000, 3,2%-ный декстран Т-500 и

1,05 М NaCI (конечные концентрации ингредиентов в суспенэионной смеси: полиэтиленгликоль 7%, декстран 2% и NaCI 0,7.M).

Смесь тщательно перемешивают, выдержи вают 20 мин при 0 С и затем центрифугируют 15 мин при 5000 об/мин. Супернатант (13,5 мл) собирают и диализуют 3 ч против

400 мл буфера А, содержащего 20 мМ калийфосфат, рН 7,4, 0,1 М NaCI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол и 0,1 -ный тритон Х-100, Отдиализованный раствор наносят на колонку (8 мл) с фосфоцеллюлозой P-11.. Колонку промывают 16 мл буфера А и белки элюируют линейным градиентом NaCI от 0,1 до 1,0 М в буфере А. Рестриктаза Втг1обычно элюируется с колонкйпри концентрации

NaCI 0,5-0,65 M. Фракции, содержащие активность рестриктазы, объединяют (12 — 15 мл) и диализуют 3 ч.против 400 мл буфера А.

Отдиализованный раствор наносят на колонку (2 мл) с гепарин-сефарозой. Колонку промывают 5 мл буфера А и белки элюируют линейным градиентом NaCI от 0,1 до

: 1,0 M в буфере А, Рестриктаза Rtr I обычно элюируется с колонки при концентраций

NaCI 0,5 — 0,7 М. Фракции, содержащие рестриктазную активность, объединяют (3-5 мл) и диализуют против 100 мл буфера Б, содержащего 10 MM трис-HCI, рН 7,4, 50 мМ

H CI, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,1 мМ ЭДТА и 50%-ный глицерин в течение 16 ч.

5 Полученный ферментный препарат хранят при -20 С в течение 6 — 12 мес.

Выход рестриктазы Rtr из 2r клеток

80000 + 20000 ед..акт. с концентрацией

80000 + 20000 ед.акт./мл.

10 Использование предлагаемого способа по сравнению с известным позволяет повысить в 6-8 раз выход. целевого фермента; сократить в 3 раза время культивирования; повысить в 30-50 раз концентрацию фер15 мента в конечном препарате.

Формула изобретения

Способ получения рестриктазы; спо20 собной узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов GTCGAC, предусматривающий культивирование продуцирующего микроорганизма в жидкой питательной среде. сбор биомассы

25 центрифугированием, дезинтеграцию клеток ультразвуком и хроматографическую очисткуфермента, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта., в качестве продуцирующего мик30 роорганизма используют штамм Rhlzoblum

trIfoiIi ВНИИСХМ В-194, перед очисткой полученный клеточный дезинтеграт фракционируют в двухфазной системе, содержащей 7%-Hûé полиэтиленгликоль и 2%-ный

35 декстран, в присутствии 0.7 М NaCI, а хро. матографическую очистку ведут последовательно на фосфоцеллюлозе P-11 и гепарин-сефарозе с элюцей раствором NaCI в концентрации 0,5 — 0,7 М, 40