Способ определения инфекционной активности вирусов в процессе хранения

 

Использование: определение инфекционной активности вирусных агентов методом БОЕ, биотехнология и вирусология. Сущность изобретения: предварительно готовят референс-препарат, включающий исследуемый вирус и защитную среду. Препарат разливают на отдельные дозы с однородным содержанием вируса в каждом объеме. Референс-препарат хранят в течение времени, при котором вирус имеет достаточную инфекционную активность с титром не менее 3 Ig БОЕ/мл. Для определения инфекционной активности исследуемого вируса, суспензию этого вируса разводят, заражают монослой культуры клеток , наносят агаровое покрытие, инкубируют и учитывают количество, и размер бляшек с последующим вычислением титра вируса. Параллельно с исследуемыми образцами определяют титр референс-препарата и сравнивают значения титров исследуемых образцов вируса со значениями титров референс-препарата. Разницу титров инфекционной активности вирусного материала определяют по формуле

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

tsi)s С 12 N 7/00

ГОСУДАРСТВЕ ННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4847745/13 (22) 02,07.90 (46) 15.09,92.Бюл. ЛЬ 34 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научнопроизводственного объединения "Вектор" (72) В,В.Хомичев, А.В,Войтенко, P.А,Зиганшин, И, Н.Терещен ко, С, Ю,Жуков и А.В. Ш абанов (56) Авторское свидетельство СССР

N 1317935, кл. С 12 Q 1/04, С 12 N 7/00, 1983.

Авторское свидетельство СССР

М 1212045, кл. С 12 N 7/00, А 61 К 39/12, 1988.

Ф.Феннер, Б,Мак-Ослен, С.Мимс, Дж,Сэмбрук, Д,Уайт, Биология вирусов животных. Т.1. М.: Мир, 1977, с. 68 — 70. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНФЕКЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ВИРУСОВ В ПРОЦЕССЕ ХРАНЕНИЯ (57) Использование: определение инфекционной активности вирусных агентов методом БОЕ, биотехнология и вирусология.

Сущность изобретения; предварительно готовят референс-препарат, включающий исследуемый вирус и защитную среду.

Техническое решение относится к области определения инфекционной активности вирусных агентов методом бляшкообразующих единиц(БОЕ) и может быть использовано в биотехнологии и вирусологии.

Известен способ определения инфекционной активности вируса включающий заражение культуры тканей исследуемым тогавирусом, инкубирование и нанесение агаровых покрытий с НЕРЕЯ, рН 7,5 — 8,0, . Я2» 1761801А1

Препарат разливают на отдельные дозы с однородным содержанием вируса в каждом объеме. Референс-препарат хранят в течение времени, при котором вирус имеет достаточную инфекционную активность с титром не менее 3 lg БОЕ/мл. Для определения инфекционной активности исследуемого вируса, суспензию этого вируса разводят, заражают монослой культуры клеток, наносят агаровое покрытие, инкубируют и учитывают количество, и размер бляшек с последующим вычислением титра вируса. Параллельно с исследуемыми образцами определяют титр референс-препарата и сравнивают значения титров исследуемых образцов вируса со значениями титров референс-препарата. Разницу титров инфекционной активности вирусного материала определяют по формуле

Т,=Т,(2) — Тх(1) — Tpn(2)+Tpn(1)+a(tz — tf), где Т,— падение инфекционности исследуемого препарата за период времени (t2 — t>); Т (1), Трп(1), Тх(2) и Tpp(2) — экспериментальные значения инфекционности исследуемого v референс-препарата в момент времени t и

tg соответственно; а — линейный коэффициент. 2 табл.

После инкубирования подсчитывают число и размеры бляшек.

Недостатком способа является низкая точность определения инфекционной активности вируса, Точность определения инфекционной активности в данном способе зависит от многих факторов: качества питательных сред, физиологического состояния культуры клеток, температурного режима и т.д. Исключить вышеуказанные факторы при определении инфекционной активно1761801 сти вирусных препаратов, хранящихся в течение длительного времени, по данному способу не представляется возможным.

Известна защитная среда, используемая для хранения вирусов и включающая пептон, лактозу и фосфатный буфер, Недостатком данной среды является то, что она не может быть использована для длительного хранения вирусов (более 1 — 2 мес), Наиболее близким способом определения инфекционной активности вируса методом БОЕ (прототипом) является способ, включающий заражение клеток чего десятикратным разведениями исследуемого препарата, После 60 минутного контакта при комнатной температуре инокулят сливают и монослой заливают полужидким агаровым покрытием, приготовленным на среде Игла

МЭМ и содержащим 0,03 / агара Difco и 1 / инактивированной сыворотки крупного рогатого скота, Монослой термостатируют при температуре 37 С, Учет бляшек производится через 8 — 9 суток.

Недостатком способа-прототипа является низкая точность on ределения инфекционной активности вируса, которая зависит от качества питательных сред, физиологического состояния культуры клеток, температурного режима, срока окраски монослоя, Целью предлагаемого технического решения является повышение точности определения инфекционной активности вируса в процессе хранения путем исключения зависимости чувствительности клеток от различных факторов: качества питательных сред, физиологического состояния самих клеток, температурного режима культивирования, сроков окраски монослоя.

Указанная цель достигается следующей совокупностью существенных признаков способа, Способ включает разведение вируссодержащей суспензии, заражение вирусом монослоя культуры клеток, нанесение агарового покрытия на монослой с последующей инкубацией и учетом количества и размера бляшек. Вируссодержащую суспензию приготавливают в виде референспрепарата, включающего защитную среду и исследуемый вирусный агент. Референспрепарат разливают на отдельные дозы с высокой однородностью содержания вирусного агента в каждом объеме дозы, консервируют, например лиофилизацией, и хранят в течение времени при котором вирус имеет достаточную инфекционную активность с титром не менее 3,0 Ig БОЕ/мл. После этого титрование отдельных доз референс-препарат осуществляют одновременно с титрованием исследуемых образцов вирусного материала и сравнивают значения титров исследуемых образцов со значениями титров доз референс-препарата. Определение разницы титров инфекционной активности

5 вирусного материала определяют из следующего выражения:

Тх=Тх(2) Тх(1) — Трп(2)+Трп(1)+а)(12 — 1)), (1) где: Тх — падение инфекционности исследуемого препарата за период времени 1г-t1(lg

10 БОЕ/мл);

Tx(1) — экспериментальное значение инфекционности исследуемого препарата в момент времени с1(lg БОЕ/мл);

Tx(2) — то же, в момент времени t2, 15 Tp(1) — экспериментальное значение инфекционности референс-препарата в момент времени t< — (Ig БОЕ/мл);

Трл(2) — то же, в момент времени т ;

a> — линейный коэффициент инактива20 ции референс-препарата (Ig БОЕ/БОЕ мл/дни, в случае, если результаты тестирования референс-препарата описываются моделью вида

y=ao+alt (2), где

25 y=lg числа БОЕ/мл; — время хранения референс-препарата; а — исходный титр референс-препарата.

30 В качестве защитной среды референспрепарата используют смесь инозита, лактозы и фосфатного буфера (МагНРО4 12H20) в растворе Хенкса при следующем количественном соотношении компонентов (вес.

35 /о): инозит 3,0 — 10,0 лактоза 2,5-7,5 фосфатный буфер (Na HP04 12НгО) 1,03,0

40 раствор Хенкса остальное.

Способ реализуется следующим образом. Перед осуществлением способа приготавливают референс-препарат на основе

1 /-ного гомогената печени морских свинок

45 инфицированных, например вирусом Марбурга, Отбор печени морских свинок производят на 6 — 7 сутки после заражения, при условии 30 /,-ного падежа взятых в эксперимент животных, Печень морских свинок из50 мельчают на гомогенизаторе Homogenezer

type MPW-302 (Польша), К 5 мл 100 /-ного гомогената прибавляют 95 мл раствора добавок: в 100 мл раствора Хенкса растворяют (2,5 — 7,5) r лактозы и (3,0 — 10,0) г инозита.

55 Полученный раствор стерилизуют автоклавированием при 121 С 2 часа. Более тонкое измельчение полученного 5/,-ного гомогената проводят на гомогенизаторе

Melesungen АС type 853202 (фирма В.Braun, ФРГ) при 1500 об/мин двукратно. После

1761801 чего рН раствора доводят до 8 01 N раствором NaOH и добавляют(1,0 — 3,0) г фосфатного буфера (NazHP04 12Н О). При этом рН становится 8,2. Полученный гомогенат разливают по 1 мл автоматической пипеткой

GiIson, 1000 во флаконы объемом 10 мл.

Флаконы помещают на полку сублимационной установки MFD-0.02 (фирма Эдвардс, Англия), Замораживают в течение 5 часов до

t -40 С. Сублимируют 28 часов при отключенном охлаждении полок. Температура продукта в конце сублимации+20 С. Досушивают 30 часов при этой температуре. Вакуум в конце досушивания 90 мк бар.

Развакуумирование производят напуском аргона, После лиофилизации флаконы герметично закупоривают и хранят при с=-12 C в морозильных камерах бытовых холодильников. Для оценки качества референс-препарата первое титрование проводилось после его месячного хранения и далее постепенно 1 — 2 раза в неделю в течение 1 года (всего 80 определений). Каждое определение по 3 — 4 повтора. За 6 мес хранения референс-препарата при t= 12 С происходит его инактивация на 0,14 Ig БОЕ. За год падение титра составило 0,28 Ig БОЕ, Следует отметить, что инфекционный вирус Марбург гомогенат печени морской свинки без защитной среды теряет свою активность в замороженном состоянии в течение 6 мес.

1 — 1,5 ig БОЕ/мл, что не годится для тестирования культур клеток, В процессе выбора количественных соотношений компонентов на основе лактозы, инозита и фосфатного буфера. Наиболее интересные данные получены на образцах 1 — 6, Для сравнения использовалась известная защитная среда (образец 7) на основе пептона, (ГОСТ

13805 — 76) лактозы и фосфатного буфера (см, таблицу 1).

Из табл. 1 видно, что предлагаемая защитная среда при следующем количественном соотношении компонентов: инозит—

30 — 100 мг/л; лактоза — 25 — 75 мг/л; фосфатный буфер — 10 — 30 мг/л обеспечивает минимальное падение биоактивности референс-препарата в процессе его хранения при t-=-12 С в течение 6 мес., что подтверждает существенность выбранных количественных соотношений компонентов защитной среды референс-препарата, Для определения инфекционной активности исследуемого вируса, например вирус Марбург, его суспензию разводят и заражают монослой клеток чего. Инкубацию проводят в течение 1 часа при комнатной температуре, после чего монослой заливают полужидким агаровым покрытием и помещают в термостате на 8 — 9 суток при

55 температуре 37 С. После чего окрашивают монослой клеток раствором генцианвиолета (0,1 раствор в 20 g,— ном этиловом спирте) и подсчитывают негативные колонии.

Параллельно с исследуемыми образцами вируса в каждый их день титрования определяют титр референс-препарата по 3 — 4 повторам и сравнивают значения титров исследуемых образцов вируса со значениями титров доз референс-препарата. Разницу титров инфекционной активности вирусного материала определяют из следующего выражения:

Тх=Тх(2) — Тх(1) Трп(2)+Трп(1)+а)(т2 11) (расшифровка условных обозначений приведена выше по тексту).

По разнице титров инфекционной активности исследуемого вирусного материала и референс-препарата в разные моменты времени судят о падении инфекционной активности исследуемого препарата за определенный период времени (в Ig БОЕ/мл).

В табл. 2 приведены данные по определению инфекционной активности вируса

Марбург методом БОЕ. Расчеты проводились по формуле (1), Значение биоактивности препарата в каждом примере определялось как среднее из трех независимых определений. осуществленных в одно и то же время. При обработке статистических данных среднеквадратично» отклонение составляет: — для исследуемых препаратов S=0,15 — для референс-препарата S=0,1

Технический эффект от использования предлагаемого способа состоит в более кор ректном сравнении биоактивности препаратов, титрованных в разное время с учетом чувствительности серий культур клеток.

Повышается точность определения инфекционной активности (не менее чем в 2 раза) за счет уменьшения доверительного интервала в 2 раза. При обработке статиc ических данных дисперсия составляет: — с использованием референс-препарата S =0,023 — без использования референс-препарата S =0,048

Формула изобретения

Способ определения инфекционной активности вирусов в процессе хранения методом бляшкообразующих единиц, включающий разведение вируссодержащей суспензии, заражениемонослоя культуры клеток, нанесение агарового покрытия. инкубацию. учет хал;;«ества и размера бляшек с последующим вычислением титра вируса, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, вируссодержащую суспензию готовят в виде референс-препарата с защитной сре1761801

Таблица1

Данные по выбору количественных соотношений компонентов защитной среды дой, представляющей собой смесь инозита, лактозы и фосфатного буфера в растворе

Хенкса, при следующем соотношении компонентов, мас. :

Инозит 3 — 10

Лактоза 2,5-7,5

Фосфатный буфер 1,0 — 3,0

Раствор Хенкса Остальное, заражение монослоя клеток производят 10 дозами с однородным содержанием вируса, хранившимися в течение времени, при котором вирус сохраняет активности не менее

3,0 Ig БОЕ/мл титрование доз референспрепарата осуществляют одновременно с 15 титрованием исследуемых образцов, а вычисление титра вируса и роводят по формуле

Тх=Тх(2)-Тх(1)— - Трп(2)+Трп(1)+а 1(т2-т1), где Тх — падение инфекционности исследуемого препарата за период времени (t>-t>);

Тх(1) — экспериментальное значение инфекционности исследуемого препарат в момент времени t>, Тх(2) — то же в момент времени 1г;

Трл(1) — экспериментальное значение инфекционности референс-препарата в момент времени t<;

Tpn(2) — то же в момент времени т2; а — линейный коэффициент инактивации референс-препарата.

1761801

Таблица2

Примеры по определению инфекционной активности вируса варбург (1g 60E/мл) в процессе хранения

Тх(2)

1g

БОБ/мл

Значение инфекционной активности исследуемого препарата через определенный период хранения

Тх(2) (1g GOE/мл) Приме ча ние

Пример

180 дней

190 дней

6, 6; 6, 7; 6, 7 1 6,4 0, 1 3 1, 6 0, 9

5 0; 5 0; 5. 1 4,8 0 085 2 9 0,7

4, 0; 4,2; 4,3 4,0 0,052 1,4 0,6

1 5 8; 5 8; 5 9

5,2; 5,2; 5,3 5,7; 5,7; 5,7

6,6; 6,7; 6,7 6,6 0,029 1,4 0,4

5,0; 5,0; 5,1 5,0 0,011 2,7 0,3

4,0; 4,2; 4,3 4,3 0,027 1,1 0,4

П р и и е ч а н и е. Доверительный интервал 95 ь .

Составитель Ю.Мистюрин

Редактор В.Трубченко Техред М,Моргентал Корректор Л,Лукач

Заказ 3235 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r, Ужгород, ул.Гагарина, 101

Значение инфекционной активности исслед. препарата на момент молуче" ния Тх (1) (1g БОБ/мл) 7,9; 8, 0; 8,2;

7,7; 7,7; 7,8;

5,1; 5,4; 5,6

5,8; 6,1; 6,3;

4,4; 4,5; 4,7

3,7; 3.8; 4,0

6,3; 6,6; 6,8

4,9; 5,0; 5,2

4,2; 4,3; 4,5 я 2 (диспе рсия) Падение инфекционной активнос ти Тх(1)

Тх(2)= <

60E/мл

Без учета референ с- пре парата (РП) (прототип) Данные по референс"пре ларату

С учетом референс препарата (предложенный способ)