Рекомбинантная плазмидная днк рмб-01 - зонд для дифференциации мuсовастеriuм воvis, м.тuвеrсulоsis от микобактерий других видов

 

Использование генетическая инженерия , ветеринарная биотехнология. Сущность изобретения: создание рекомбинантной плазмидной ДНК рМБ-01; содержащей видоспецифический фрагмент генома М. tupus bovinus, размером 2400 н. п. в векторе pBR332. Идентификация микобактерий ДНК-ДНК гибридизации с использованием плазмиды рМБ-01 в качестве гибридизационного зонда позволяет с высокой достоверностью , меньшими затратами труда и времени специалистов проводить идентификацию микобактерий видов Bovis, Tuberculosis и их дифференциацию от микобактерий других видов. Способ найдет применение в практике ветеринарных бактериологических лабораторий, занимающихся диагностикой туберкулеза. 3 ил. 2 табл. СП с

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4816341/13 (22) 18.04.90 (46) 07.06.92. Бюл, Ф 21 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я. P. Коваленко (72) Г. Ф. Коромыслов, Я. А. Бортюк, С. К. Артюшин, Б. А. Фомин, В. И. Косенко и Н. P. Овдиенко (53) 575.224.2571.2.(088.8) (56) Tuburole, 1988, М 69, р. 27-36. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

ДНК рМБ-01 — ЗОНД ДЛЯ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ MYCOBAKTERIUM BOVIS, M.

TUBERCULOSIS ОТ МИКОБАКТЕРИЙ ДРУГИХ ВИДОВ (57) Использование генетическая инженерия, ветеринарная биотехнология. СущИзобретение относится к генной инженерии и ветеринарной биотехнологии, а именно к созданию средства дифференциации M. bovis, M. tuberculosis от микобактерий других видов.

Цель изобретения — повышение специфичности способа дифференциации указанных микобактерий.

Поставленная цель достигается клонированием ДНК M. bovls BCG в плаэмидном векторе pBR-322 и последующим выделением из полученной клонотеки фрагмента

ДНК, специфичного для M. bovis, М.

tuberculosis.

На фиг; 1-3 представлены результаты исследований.

Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды рМБ-01,,. Ж, 1738856 А1 (st)s С 12 N 15/31, С 12 0 1/68 ность изобретения: создание рекомбинантной плазмидной ДНК рМБ — 01; содержащей видоспецифический фрагмент генома М, tupus bovinus, размером 2400 н. и. s векторе

pBR332. Идентификация микобактерий

ДНК-ДНК гибридизации с использованием плазмиды рМБ-01 в качестве гибридизационного зонда позволяет с высокой достоверностью, меньшими затратами труда и времени специалистов проводить идентификацию микобактерий видов Bovis, Tuberculosis и их дифференциацию от микобактерий других видов, Способ найдет применение в практике ветеринарных бактериологических лабораторий, занимающихся диагностикой туберкулеза. 3 ил. 2 табл.

ДНК M. bovis BCG расщепляли зндонуклеаэой Pst I в условиях неполного гидролиза. Затем с помощью препаративного злектрофореэа из общего пула выделяли фрагменты размером 1-4 т. и. н. 1 мкг этих фрагментов смешивали с 0,2 мкг плазмиды

pBR — 322, расщепленной Pst I в буфере, содержащем 1 ед. ДНК-лигаэы фага Т4, и инкубировали 16 ч при 12 С. После инкубации смесью трансформировали компетентные клетки Е. соИ штамма TG-1, высевали на агаризированную среду, содержащую тетрациклин и инкубировааи в течение ночи при 37 С. Выросшие колонии перекалывались одновременно на чашки с ампициллином и тетрациклином. Из колоний, которые росли только на чашках с тетрациклином, т. е. имели фенотип Тс Ар . выделялись плазмиды. 0,2 мкг препаратов плазмид наносили

1738856 на нитроцеллюлозный фильтр и анализировали их в реакции ДНК вЂ” ДНК гибридизации с ДНК M. bovis и ДНК микобактерий комплекса avium — intracellularae, меченных Р з2 методом ник-трансляции. Гибридизацию проводили в растворе, содержащем 2" ССР (стандартный солевой раствор), 5" раствор

Денхарда, 50 деиониэированного формамида, 0,1 додецилсульфата натрия (ДСН), 100 мкг/мл ДНК спермы лосося, в течение ночи при 45 С. Фильтры отмывали в 2"ССР, 0,5 ДСН 20 мин при комнатной температуре и 20 мин при 60 С, затем в 0,1 CCP

20 мин при 60 С и 20 мин при комнатной температуре. Радиоавтографию проводили в кассете с усиливающим экраном с использованием радиоавтографической пленки

PM — В (НПО "Свемэ") в течение 48 ч, В результате проведенного исследования была выделена рекомбинантная плазмида, получившая впоследствии название рМБ-01, которая давала хороший положительный сигнал при гибридизации с ДНК M. Bovis

BCG и практически не гибридиэовалась с

ДНК микобактерий комплекса aviumIntraceIlularae. Рестриктная карта этой плазмиды приведена на фиг.1.

Процедуры лигирования, трансформации, селекции клонов, выделения плазмид и гибридизации проводили по общепринятым методикам.

Пример 2, Проверка специфичности фрагмента ДНК M. Bovls ВС6 содержащегося в плазмиде рМБ-01.

Плазмиду рМБ-01 расщепляли рестриктазой Pst I и проводили препэративное выделение клонированного фрагмента.

Препараты ДНК различных видов микобактерий наносили на нитроцеллюлозный фильтр по 0,2 мкг в точку и гибридизовали с выделенным фрагментом, меченным P.

32

Гибридизацию, отмывку фильтров и радиоавтографию проводили, как описано в примере 1.

Результаты исследований приведены на фиг, 2. Кэк видно из представленных данных, положительные сигналы, свидетельствующие о гибридизации клонированкой последовательности с ДНК микобактерий, отмечены в местах нанесения М. bovls (точки А1 и А2), M. bovis BCG (точки С1-С4). При этом не отмечалось положительных сигналов в точках нанесения ДНК микобактерий других видов.

Полученные данные свидетельствуют, о специфичности используемого зонда по отношению к ДНК М. bovls.

Пример 3. Использование выделенного фрагмента ДН К М. dovls 8CG для дифференциации культур М. bovls, М.

tuberculosis от культур микобактерий других видов, Для приготовления препаратов культур микобактерий культуры микобактерий (39

5 препаратов по 0,1 г) суспендировали в 50 мкл лизирующего раствора (0,2 М NaOH, 1 додецилсульфата натрия). Суспенэии культур инкубировали 20 мин при 100 С, затем быстро остудили.ао льду и центрифугирова10 ли 10 мин при 10000g. Супернатант, содержащий лизаты культур, нанесли на нитроцеллюлоэный фильтр по 5 мкл в точку.

Нитроцеллюлозные фильтры с нанесен15 ными культурами микобактерий гибридизировали с меченным P выделенным фрагментом ДНК М, bovls BCG; Гибридизацию, отмывку фильтров и радиоавтографию проводили, как описано в примере 1.

20 Результаты реакции представлены на фиг.3. Как видно иэ полученных данных, все шесть препаратов М. bovls и два М.

tuberculosis дали положительные сигналы .

{точки Д2, ДЗ. Е2-Е7). В точку А5 нанесли 10

25 нг ДНК М, bovls ВС6 (положительный контроль), э в точку Е8 — 1 мкг ДНК селезенки теленка(отрицательный контроль). В местах нанесения лизатов культур микобактерий других видов сигналы либо отсутствуют со30 всем, либо существенно слабее сигналов в местах нанесения М. ЬоФз, M. tuberculosis.

Изобретение поясняется табл. 1 и 2.

В результате проведенного эксперимента можно однозначно отличить места на35 несения лизатов культур M. bovis, М.

tuberculosis от мест нанесения лиэатов культур микобактерий других видов. Следовательно, полученные в этом примере результаты свидетельствуют, что выделенная

40 нуклеотидная последовательность ДНК M.

bovis ВС6 может использоваться для дифференциации M. bovis, М. tuberculosis от микобактерий других видов.

45 Предложенная рекомбинантная плаз- мида рМБ-01, содержащая фрагмент ДНК

M. bovls BCG„M. bovis, M.

tuberculosis, найдет применение в ветери- . нарных бактериологических лабораториях, .

50 занимающихся диагностикой туберкулеза, а также в научно-исследовательской работе, направленной на совершенствование методов диагностики туберкулеза.

55 Ф о р м.у л а и э о б р е т е н и я

Рекомбинантная плазмидная ДНК р МБ-01 — зонд для дифференциации

Mycobacterium bovis, M. tuberculosis от микобактерий других видов размером 6781 п.н., содержащая — Pst — Pst — фрагмент генома М. bovlnus ВС6. размером 2400 н. и.

173В856 с 2 сайтами рестрикции 8am Н1 и сайтом -генетические маркеры; Tet"- ген устойчирестрикции Ndel: ДИК плазмиды p8R322; вости к тетрациклину.

Ц Таблица1

»«»

Место на- ДНЕ микобактерий несения препарата Вид Итамм

Результат реакции

» «» «» «»«»«»» »«»

»»

» е

200

А1

Ча11е

Bovis

А2

200

Bovis

18020

200

А3

Mari nu7Ii

200

А4

Kansassii

Fortuiturl

200

А5

Starr Gidden

Intracellu. larae

Scrofulaсещ»

200

157

В1

200

Bridge

В2

200

ScofulaСЕаа7

Av iurlI

Aviurll

Bovis . Bovis

Bov is

Bovis

Bovis

P-29

200

700

200

6195

В5

250 BCG

С2

BCG

БСС

ВСС

С4

С5

0,4

fl p и м е ц а н и е. "+" - положительный сигнал, ".-" - отрицатель. ный сигнал

Т ° бл мц ° 2

Реэуль- место маваг несеник. реакции препарата

Hecro нанесанмп препарата

Лизаты культур никобактепнй реэ ультат реакции

Лизаты культур микобактармй

Вид (Птанн

Вмд

444М 237

:1 6909-2380

14141-.139S 1

780 .

Valise

157 в а BridBe

7-29, IIeInih

7-54

V 622

V8I I en

17 °

118 мбм:

Ъ" селеаемкм ИРС в

11 Р и н е и а и и е. 85 - нзоллт кУпьтУРм ннкобактеРий, амделемньвт мз гвнаоогэлов головы КРСь 86 мволаг микобактеРийв выЦепеннмй нэ лннРоузлое ливера KPC.

AI

А2

АЭ

А4

AS

А6

А7

АВ

В1

82

ВЗ

ВФ

bS

В6

В7

bB

C1

С2

C3

С4

Phl el

In4race1lu1arae

1пагасеИо1агве

Ивпзавзй

Днк 10 нг

Тегае

Изгlома

PortuitIsI

Intracc1lularae

1nt race11ulвгвв

1nt глсе1 1-ul arse

Intrace11u1arae

Изолпт А

Неолит в,.

IlIttacel1uIaTae

Ат1ьаа

Inc ra c e l l Ill a tee

Iпсгасеllеlагае

Intrecellularae

Iпггасеllмlлгае

Гhl ei

ТЛ10етс

0arden

Ивпазаа1а

И.Ьок1з ВОС

Yri v i a11 å l tl rinInI

10194 .11зчгзу

500Р,/19

34540.

Yand1e

2977

2977

12928

Vitorh

290/152 .

Р-40

39

11528

CS с6

С7

CB

01

02

03

04

0S

06

07

08

Е1

Е2

ЕЭ

14

Е6

Е7

Е8

Intrscellu1arse

АНна

Avius

А91ма

Aviun

bov is

bovis

Iпсгвсаllulerae

Snebnatis

ScrofuIecceIsa

ЗсгоЕк1ассеьаа

1псгасе11мlагае

Intracellularae.

Bovis

Bovi °

Вог Гв

Вот 1 °

ТеЬегсоlов is:

ТеЬегсо1оз1 °

Iикк >INK

173885б

ECORI йо®

0 PQ2. 2

1738856

1 z ? 4 5 о

Составитель В. Свиридова

Техред M.Моргентал Корректор О. Кравцова

Редактор В. Петраш

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 1978 . Тираж Подписное

:ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5