Фрагмент нуклеиновых кислот - зонд для выделения и идентификации флавивирусов
Изобретение относится к биотехнологии , конкретно к конструированию фрагментов нуклеиновых кислот, которые могут быть использованы в вирусологии и эпидемиологии, для выявления и идентификации флавивирусов, переносимых комарами из подгрупп японского энцефалита, лихорадки денге и желтой лихорадки. Для этого синтезировали химически с использованием в качестве мономеров защищенных дезоксинуклеозидов олигокуклеотид, состоящий из 20 оснований, следующей последовательности: 5-dGGGTCTCCTCTAACCTCTAC-3 Эта последовательность идентична для всех расшифрованных флавивирусов, переносимых комарами. Использование синтезированного зонда позволяет быстро и просто тестировать исследуемый материал на наличие флавивирусов . 2 табл.
СООЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУ6ЛИН рц С 12 О 1/68
ФАРИИ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К A STOPCH0MV СВИДЕТЕЛЬСТВУ дщдя е т
ЬИЬЛИ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗО6РЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР (21) 4665914/13 (22) 23.03,89 (46) 23.09.91. Бюл. Н 35 (71) Новосибирский институт биоорганической химии СО АН СССР (72) В,А,йаманин, В,И.Злобин и А,Г.Плетнев (53) 575.224.2: 577.2(048) (088.8)
1 (54) ФРАГМЕНТ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ
ЗОНД ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ
ФПАВИВИРУСОВ, ПЕРЕНОСИМЫХ КОМАРАМИ (57) Иэобрегение относится к биотехнологии, конкретно к конструированию фрагментов нуклеиновых кислот, которые могут быть использованы в вирусологии и эпидемиологии, для выявлеИзобретение относится к биотехнологии, а именно к Фрагментам нукле-. иновых кислот (НК), и может бьть ис»"пользовано в эпидемиологии, вирусологии для выявления и идентификации флавивирусов, переносимых комарами (ФПК) из подгрупп японского энцефалита, лихорадки денге и желтой лихорадки.
Создан простой и безопасный в по.лучении„воспроизводимый по результатам гестирования, зонд для выявления и идентификации ФПК иэ подгрупп японского энцефалита, лихорадки денге и желтой лихорадки, который значительно облегчает задачу по получе,ию коммерческих тест-наборов для ;. ь,*явления и идентификации
Флавивирусов °
„„SU„„1678837 А 1
2 ния и идентификации флавивирусов, переносимых комарами из подгрупп японского энцефалита, лихорадки денге и желтой лихорадки. Для этого синтезировали химически с использованием в качестве мономеров защищенных дезоксинуклеозидов олигонуклеотид, состоящий из 20 оснований, следующей последовательности:
5-dGGGTCTCCTCTAACCTCTAG-.3.
Эта последовательность идентична для всех расшифрованных флавивирусов, переносимых кома рами . Ис пол ь зова ни е синтезированного зонда позволяет быстро и просто тестировать иссле.дуемый материал на наличие флавивирусов, 2 табл. Я
Зонд йредставляет собой дезоксиолигонуклеотид длиной 20 звеньев, который синтезируют химическим методом с использованием в качестве исходных компонентов модифицированных (защищенных) дезоксиолигонуклеотидов. Фрагмент НК имеет следующую нуклеотидную последовательность:
5 -ciGGGTCTCCTCTAACCTCTAG-3 .
Фрагмент для выявления и идентификации ФПК сконструирован на основе анализа известных нуклеотидных последовательностей геномов для ряда эта- 3 лонных флавивирусов. При этом в районе 130 нуклеотидов от 3 — конца геr нома обнаружена последовательность из
20 нуклеотидов, идентичная для всех расшифрованных ФПК (вируса японского
1678837 энцефалита, вируса Западного Нила, энцефалита долины Мюрреи, вируса желтой лихорадки, вируса лихорадки Денге )
2 следующего состава: (51-3 ) CUAGAGGUUAGAGGAGACCC.
Синтезированный фосфитамидным ме" тодом предла гаемый фра гмент НК, комплемента рный выя вленной последова тел ь q p ности, испытан с целью его применения в качестве зонда для выявления и идентификации ФПК. Для испытаний исполь зуют штаммы вирусов, полученные из
Гос ударст венной "колле кции вирусов И н- 15 ститута вирусологии им. !.И.Иванского и, следовательно, отличные от эталонных, полученных эа рубежом.
Пример 1, Синтез дезоксиолигонуклеотида - фрагмента НК, Фрагмент HK синтезируют в количестве 1-10 оптических единиц (о.е.) на автоматическом синтезатора фосфи та мидным методом испол ь эуя в качестве мономеров 5 -О-диметокситритил- 5
-N-а цил-3 - (Р-метилдии зопропиламид) фосфаты нуклеозидов. Чистоту полученных НК проверяют электрофорезом в 203-ном денатурирующем полиакрилвмидном геле. Синтезированный дезоксиолигонуклеотид был не менее 803-ной чистоты. Структуру фрагмента подтверждают анализом по Максаму-Гилберту, Пример 2. Испытание полученного фрагмента НК в качестве зон,да для выявления и идентификации комариных флавивирусов.
Вирусы, В работе используют вирусы, полученные из государственной . коллекции вирусов при Институте ви- 40 русологии им. Д.И.Ивановского. В качестве вирусного материала используют мозг. зараженных мышей. Белых беспородных мышей массой 6-8 r заражают в мозг 0,03 мл. суспензии вируса, со— держащей около 6,0 1g ЛД . вируса.
Жи нотных, заби ва ют при поя влении клинических симптомов заболевания на
4-7 сут от момента заражения. Иозг препарируют и хранят при -40 С. В
Р
:качестве образцов для анализа берут суммарную PHK мозга.
Выделение суммарной PHK мозга.
Суммарную РНК выделяют экстракцией горячим кислым фенолом (60 С, рН 5,2) в присутствии додецилсульфата натрия
55 (О, 5-1, 0 мас.Ъ объем) с последующим спиртовым осаждением. Осадок PHK собирают центрифугированием 30 мин при 6000 об/мин, Осадок растворяют в буфере 7,5ь формальдегид - 10 мй нат. рий фосфат, рН 7,0, и определяют концентрацию PHK спектрофотометрически, принимая o.е. А ь = 40 мкг PHK.
Иммобилизация PHK на нитроцеллюлозных фильтрах. PHK денатурируют прогревом в 7,54-ном растворе формальдегида 15 мин при 56 С, затем добавляют раствор 20 s SSC (3, О И натрий хлорид - 0,3 М натрий цитрат, рН 7,0) rо концентрации 10wSSC и образцы PHK наносят на нитроцеллюлозные фильтры, Фильтры сушат при комнатнсй температуре 15-30 мин, а затем в вакуумном сушильном шкафу 2 ч при 80 С.
Мечение олигонуклеотидов. Олигонуклеотиды метят с помощью полинуклеотидкиназы Т4 (13) в присутствии
5 P-ATP (1000 Ки/ммоль) до удельной активности 500-1000 Ки/ммоль олигонуклеотида.
Гибридизация, Нитроцеллюлозные фильтры с иммобилизованными препаратами PHK инкубируют в гибридизационной смеси состава: 6
ДНК быка при 65 С в течение 1 ч. Затем добавляюг + Р-меченый олигонуклеотид (0,2-0,5 пмоль/мл) и гибридизуют 6-18 ч при 45 С. Радиоактивность, связавшуюся с фильтрами, выявляют радиоавтографией на рентгеновскую пленку с усиливающим экраном или просчетом радиоактивности на жид . костном с ци нти лля цио ином с четчи ке, Положительными принимались сигналы, превышающие уровень фона отрицательного контроля в 2-3 раза.
Для подтверждения высокой специфичности полученного зонда испыта-. ния проведены на ряде флавивирусов, перечень которых и условные обозначения приведены в табл,1, Результаты дифференциальной детекции флавивирусов с помощью синтетического зонда-Фрагмента НК при ведены в табл.2, Как видно из табл,2, зонд, комплементарный геномнрй PHK комариных фла-; вивирусов, реагирует в наибольшей степени с флавивирусами подгрупп японского энцефалита и Денге. Реакция зонда с Флавивирусами комплекТабл и ца !
1О
Вирус
Омская геморрагическая лихорадка
ОГЛ
Киасанурская лесная болезнь
КЛБ
Нег
Негиши
Лангат
Лан
Повассан
Пов
ШЭО
Вирус Западного
Нила
Энцефалит долины
Мюррей
ВЗН
ЭДМ
ЭСЛ
Энцефалит Сен-Луи
Вирус японского энцефалита
ВЯЭ
Подгруппа Денге
45 Вирус Ленге 2 цен
Таблица 2
Гибридизация имп/мин (Ф), по опыту
Вирус
Комплекс клещевого энцефалита
89 (2,9) 89 (3,2)
86 (3,1)
85 (3)
83 (3)
80 (2,9) ВКЭ
ОГЛ
КЛ6
Нег
Лан
91 (3)
88 (2,9)
92 (3)
91 (2,9) 5 ! б са клещевого энцефалита, которые пе-реносятся клещами, незначительна и не превышает 8,3Ф (вирус Повассан) от уровня реакции с ВЯЭ.
Высокую производительность предлагаемого метода иллюстрируют данные повторных экспериментов с двумя препаратами зонда. Оба препарата высокоспецифично реагируют с комариными флавивирусами с близким уровнем гибридизации (301Р и 2767 импlмин для ВЯЭ в опытах 1 и 2 соответственно). Уровень гибридизации с вирусами комплекса клещевого энцефалита варьирует незначительно и не превышает 8,3 и 8,8ã. (вирус Повассан) в опытах относительно эталонного вируса японского энцефалита, При этом использование предлагаемого Фрагмента НК для выявления и идентификации ФПК обеспечивает спев дующие преимущества.";имеющиеся в- настоящее время автоматические синтезаторы олигонуклеотидов позволяют просто и быстро получать любые фрагменты НК длиной до 30-70 нуклеотидов при получении зонда исключается работа с вирусами, обеспечивается возможность получения зондов практически в любых необходимых количествах, s отличие от моноклональных антител возможен контроль зонда путем проверки его химической структуры, в отличие QT моноклональных антител возможно прогнозирование специфичности зонда, появляется возможность решения задачи по получению коммерческих тест-наборов для выявления и идентификации большого числа флавивирусов.
Формула и э о б р е т е н и я
Фрагмент нуклеиновой кислотызонд для выявления и идентификации флавивирусов, переносимых комарами размером 20 нуклеотидов, синтезиро7883 7 ванный химин"".:.си .. использованием в качестве мономеров модифицированHblx защищенных дезоксинуклеозидов и . характеризующийся следующей нуклеотидной последовательностью:
5t -dGGGTCTCCTCTAACCTCTAG-3 i, Комплекс клещевого энцефалита
Вирус клещевого эн-цефалита, штамм
Софьин ВКЭ
Шотландский энце.Фаломиелит овец
ЗО
Подгруппа японского энцефалита
1678837
11Родолжение та6л.2
Гибридиэаииа, имп/мин ((g) по опыту ф
iã !
1 2 !
Ви рус
250 (8,3) 243 (8,8)
121 (4) 111 (4)
Подгруппа японского энцефалита
3018 (100) 2767 (100)
2324 (77) 2269 (82)
2113 (70) 1799 (65)
2052 (68) 1743 (63) "
Подгруппа Денге
2686 (89) .т 90 (3) Пов
ШЭО
ВЯЭ
ВЗН
ЭДМ
ЭСЛ
2601 (94) 89 (3) pew 2
Контроль""
Гибридизация приведена в количестве радиоактивности (имп/мин) и в Ф относительно ВЯЭ. ,. РНК нормального мозга мыши.
Составитель Е. Кузнецова
Техред Л.Олийнык ., Редактор Н. Козлова
Корректор Н. Ревская
Заказ 3990 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская над., д. 4/5
Производственно-нзд.1тельский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101
