Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l.-продуцент моноклональных антител к к99 адгезивному антигену еsснеriснiа coli

 

Использование: биотехнология, иммунология . Сущность изобретения; получают штамм путем гибридизации миеломных клеток линии Х-63-Ад-8.653 со спленоцитами мышей, иммунизированных К99. Штамм обозначен 3F6D и хранится под номером ВСКК(П) № 519 D. Штамм продуцирует моноклональные антитела, специфически взаимодействующие с К99 антигеном E.coli с мол. массой 18.5 KDa. Титр антител в асцитной жидкости достигает 1:200000. (Л с

СОЮЗ СОВЕ ТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

<я)з С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4916435/13 (22) 30.11.90 (46) 07.11,92, Бюл. ¹ 41 (71) Цел и но градский сел ьскохозя йствен н ый институт Госагропрома СССР, Всесоюзный научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я,Р,Коваленко (72) К.К.Муканов, К.Н.Мукантаев, T.O.Ñûðманов, Б.Н.Кенжебулатов, 3.А, Шегидевич и

Н.А.Соколова (56) D.V.Anderson etal. Veterinary

immunology апд tmmunopathology, 1987, ч.15, р.223-237. Bovine Monoclonal

Antibodies to the F5(#99) PiIus Antigen of

Е,coll, Produced by Murine/Bovine

Hydridornas.

P.l, Sadowski etal. Infection and !

mmunity, 1983, ч.42, ¹ 2, р.653-658.

Protection of Calves Aqelnst Fatal Enterlc

Colibaclllosls by Orally AdmlnlsterIe

Escherlchfa coli К99 — specific Monoclonal

Antibody, Изобретение относится к гибридной технологии и может быть использовано в ветеринарии для диагностики желудочнокишечных заболеваний животных, вызываемых Escherichia coii.

Известен штамм ксеногибридомы 94А1, продуцирующей моноклональные антитела к К99 антигену Е.со11. Для ее получения использовали мышиную миелому NSO (сублиния NS/1 Ag 4.1) и лимфоциты теленка, не секретирующие иммуноглобулины, При этом получены ксеногибридомы 53ВЗ и

53В4, не секретирующие иммуноглобулины.

Затем ксеногибридома 53ВЗ сливалась с лимфоцитами теленка, секретирующие им„„ ) „„1773938 А1 (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ MUS

MUSCULUS L.-ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К К99 АДГЕЗИВНОМУ АНТИГЕНУ ESCHERICHIA COLI (57) Использование: биотехнология, иммунология. Сущность изобретения; получают штамм путем гибридизации миеломных клеток линии Х-63-Ag-8.653 со спленоцитами мышей, иммунизированных К99, Штамм обозначен 3F6D и хранится под номером

ВСКК(П) ¹ 519 D. Штамм продуцирует моноклональные антитела, специфически взаимодействующие с К99 антигеном Е,со11 с мол. массой 18.5 КОа. Титр антител в асцитной жидкости достигает 1:200000. муноглобулины к К99 антигену Е.со11, В результате этих экспериментов получена ксеногибридома 94А1, продуцирующие моноклональные антитела к К99 антигену

Е.coli (D,V.Anderson et al., Bovine

monoclonal antibodies to the F5 (К99) pilus

antigen of Е.coil produset by nurine/bovine

Nybridomas.. Vet. immunology and

Immunopatology, 1987, ч.15, р.223 — 237).

Кроме того, известен штамм гибридных клеток 2ВД4Е4, продуцирующий моноклональные антитела к К99 антигену Е,coli штамма В44 и В41. Продуцируемые антитела относятся к классу 61, а титр антител, очищенных из асцитной жидкости, составил

1:12000. Концентрация иммуноглобулинов составляла 45-50% белка асцитной жидкости. Гибридома получена при слиянии спленоцитов иммунизированных мышей и миеломной клетки линии РЗ вЂ” NS — 1 — Ag 4/1.

Моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой 2ВД4Е1, использовали для лечения телят, экспериментально зараженных К99 позитивными штаммами Е;соИ, Результаты опыта показали, что заболеваемость в контрольной группе составила 82%, обезвоживание организма животных 82% и смертность 82%,тогда как в опытной группе животных заболеваемость составила 75%, обезвоживание организма 29% и смертность 29%, Таким образом, показана возможность использования моноклональных антител для лечения телят больных колибактериозом. Данный штамм взят за прототип (Sadowski РЛ. et al„Protection of Calvel

Against Fatal Enteric ColIbaclllosis by Огай

Administered Escherichia coll К99-specific

monoclona1 Antibody. — InFectlon and

Immunity, 1983, н,42, М 2.

Таким образом, анализ литературы показывает, что в настоящее время известны два штамма гибридных клеток, продуцирующих моноклональные антитела к К99 антигену. Указанные выше моноклональные антитела был использованы для лечебных целей.

В связи с тем, что антитела из асцитной жидкости, продуцируемые гибридомой

2ВД4Е4 обладают сравнительно низкой активностью 1:12000 и продуктивностью 4550%, они менее пригодны для использования в диагностических целях.

Учитывая вышеизложенное, получена гибридома 3F6D, продуцирующая моноклональные антитела к К99 антигену Е. соН с достаточно высокой аффинностью. Это дает возможность использовать эти моноклональные антитела в диагностических целях, Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток, продуцирующего моноклональные антитела к К99 адгезивному антигену Е,соИ.

Штамм гибридных клеток получен путем слияния миеломной клетки линии Х-63Ag-8-653 со спленоцитами мышей, иммунизированных4 раза сдвухнедельным интервалом, очищенным дифференциальным ультрацентрифугированием К99 антигеном Е.coll штамма 09. Первую иммунизацию проводили 10 мкг К99 антигена с полным адьювантом Фрейнда, 2 и 3 иммунизацию такой же дозой антигена с неполным адьювантом Фрейнда. Последнюю иммунизацию проводили 10 мкг анти гена в 0,15 M фосфатно-буферном растворе и через 2 дня клетки селезенки использовали для гибридизации. Гибридизацию проводили добавлением к смеси 4х10 миеломных

6 клеток и 20х10 спленоцитов 1 мл раствора, 6

5 содержащего 45% ПЭ Г-4000, 10% диметилсульфоксида и 45% среды RPM1-1640. 3атем оставляли для инкубации на 10 мин, После этого клетки осаждали центрифугированием при 1000 об/мин в течение 10 мин.

10 Осадок клеток ресуспендировали в среде йРМ1-1640 с добавлением 10% по объему эмбриональной сыворотки теленка и высевали в 96-луночные планшеты по 100 мкл на лунку. На следующий день в эти лунки вно15 сили среду с гипоксантином, аминоптерином и тимидином (ГАТ). Через каждые 3-4 дня проводили подкармливание клеток. 4ерез 10 — 14 дней после слияния в лунках, имеющих колонии клеток размером 2 — 3 мм, 20 отбирали культуральную среду для определения продуктивности гибридных клеток.

Тестирование проводили методом иммуноферментного анализа с использованием очищенного К99 антигена методом диффе25 ренциального ультрацентрифугирования и кроличьих иммуноглобулинов к антителам мыши, меченных пероксидазой. В течение

21 дня после слияния клетки находились в среде ГАТ. Затем постепенно переводились

30 на среду ГТ и полную среду RPM1-1640. Клоны клеток, продуцирующие моноклональные антитела, дважды клонированы методом лимитирующего разведения. После второго клонирования 100% субклонов

35 продуцировали антитела к К99 адгезивному антигену Escherlchla соН. Штамм гибридных клеток продуцирует антитела в культуральную среду и в асцитную жидкость.

Штамм гибридных клеток 3F60 хранит40 ся в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН

СССР под номером ВСКК(П) 519 Д. Штамм характеризуется следующими свойствами.

45 Морфологические свойства. Гибридные клетки представляют собой слабоприкрепляющиеся к носителю округлые клетки размером с исходную миеломную клетку, Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплаз50 ма имеет вид тонкого ободка.

Культуральные свойства. Гибридные клетки выращивают в среде RPM1-1640, содержащей инактивированную нагреванием сыворотку эмбрионал коров (10-20%), (55 глютамина 200 мМ (20 мл/л), HEPES — (3,375

r/л), 1х10 пируват натрия; 2-меркаптоэтанол (5х10 М), пенициллин (100 ед/мл), стрептомицин (100 мкгlмл), бикарбонат натрия 37 г/л), Клетки культивируют при 37 С в атмосфере 5% СОг. Характер роста — стационар1773938

35

55 ная суспензия, Посевная концентрация клеток 2х10 клеток в 1 мл. Частота пассирования клеток через 2-3 сут. При внутрибрюшинном введении сингенным мышам штамм гибридомы образует опухоль в асцитной форме на 14 — 18 день. Доза клеток при прививке.2х10 клеток. За 14 дней до введения гибридомы мышам инъецировали 2,6,10,14-тетраметилпентадекан в дозе 0,5 мл на голову. Штамм сохраняет способность продуцировать специфические моноклональные антитела в течение 4 пассажей на сингенных мышах (время наблюдения).

Продуктивность штамма, На 8 день культивирования гибридомы концентрация антител достигает 5 мкг/мл в культуральной среде. В очищенной асцитной жидкости концентрация иммуноглобулинов составляет 8 мгlмл, а их титр 1:200000.

Характеристика полезного продукта.

Моноклональные антитела относятся к иммуноглобулинам подкласса 61. Моноклональные антитела специфически взаимодействуют с К99 антигеном Е.соИ с молекулярной массой 18,5 КДэ. Специфичность моноклональных антител определяли методом иммуноблотинга, Контаминация. Контаминантов в клетках, включая бактерии, грибы, дрожжи и микоплазмы, не обнаружено.

Криоконсервация, К осадку гибридных клеток добавляли эмбриональную сыворотку коров, а затем диметилсульфоксид до конечной концентрации 10%, Суспензию разливали в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 2х10 клеток в объеме 1 мл. Ампулы помещали в коробку из пенопласта и оставляли нэ сутки при -70 С, а затем переносили в жидкий азот, Условия размораживания. Замороженную ампулу быстро помещали в водяную баню на 37 С. Как только растают последние кусочки льда, суспензию клеток переносили стерильно в пробирку, содержащую 10 мл холодной безсывороточной среды, отмывали один раз и засевали в ячейки 24-луночной планшеты с питающим слоем перетониальных макрофагов. Число жизнеспособных клеток после размораживания не менее 607.

Штамм 3F6D используют следующим образом.

Пример 1. Гибридные клетки помещают в пластиковые матрасы площадью 25 см по 5х10 клеток в 5 мл питательной среды и инкубируют 3 дня при 37ОC е атмосфере 5 ) СО2. Культуральную среду собирают и центрифугируют 10 мин при 800g с целью отделения клеток от надосэдочной жидкости, содержащую антитела. При культивировании гибридомы на мышах иммуноглобулины из асцитной жидкости получали методом высаливания сульфатом аммония до 50 (насыщения. Для этого в асцитную жидкость добавляют равный объем 0.15 M фосфатно-буферного раствора (ФБР), рН 7,2. Затем добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония и оставляют при перемешивании на ночь при 4 С. Иммуноглобулины отделяют центрифугировэнием при 5000 об/мин в течение 30 мин, при 4 С. Осадок антител ресуспендируют в минимальном объеме ФБР.

Пример 2. На нитроцеллюлозную мембрану, предварительно нарезанную на

8 полос, наносят по 1 мкл раститрованного

К99 антигена. Раститровку проводят с 10 мкгlмл до 1 нг/мл. Полоски мембраны инкубируют 1 ч при 37 С в 1,5;ь BSA для забивки свободных поверхностей мембраны. После инкубирования полоски отмывают 3 раза по

10 мин в 0,15 МФБР с 0,,1 Твином-20 (ФБР-Тв), Отмытые полоски инкубируют 1 ч при 37 С в 8 разведениях моноклональных антител с 1:1000 до 1:12000. После инкубирования полоски мембраны отмывают, как описано выше, и инкубируют в растворе с антителами кролика против иммуноглобулинов мышей, меченных пероксидазой хрена.

Через 1 ч инкубирования при 37 С повторяют процедуру отмывки с целью удаления несвязанных компонентов реакции. Реакцию проявляли добавлением субстрата.

Субстрат готовится растворением 8 мг 4хлорнафтола в 1 мл этанола и добавлением

9 мл ФБР и 5 мкл 30;4-ного раствора перекиси водорода. Рабочее разведение моноклональных антител составляет 1:1000, т.е. при таком разведении антитела выявляют 1 нг/мл К99 антигена.

Пример 3. Для определения молекулярной массы белка, к которому получены моноклональные антитела, проводят злектрофорез и перенос белка на нитроцеллюлозную мембрану с последующим иммунохимическим проявлением (иммуноблотинг). Электрофорез белка проводят в

11 полиакриламидном геле в присутствии

0,1 додецилсульфата натрия. Перенос белка на нитроцеллюлозную мембрану проводят методом полусухого электроблотинга в аппарате фирмы "Hoefer Scientific

instruments" при силе тока 0,8 А на 1 см геля, в течение 2 ч, Окрашенный гель был исследован на денситометре с программным обеспечением для компьютера фирмы

"Hoefer Scientific".

1773938

Составитель И. Крушина

Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор А, Андрюшенко

Редактор А. Кулакова

Заказ 3908 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Нитроцеллюлозную мембрану используют для иммунохимического проявления антителами. Для этого нитроцеллюлозную мембрану инкубируют в 1,5$ BSA в течение ночи при комнатной температуре, затем инкубируют в растворе очищенного препарата антител в разведении 1500 в течение

1 ч. После этого носитель инкубируют в течение 1 ч при 37 С с антителами кролика против иммуноглобулинов мыши, коньюгированных с пероксидазой хрена. Реакцию проявляют субстратом, содержащим 4хлор-нафтол, перекись водорода, ФБР.

Результат, Иммуноблотинг показал, что моноклональные антитела специфически связываются с белком молекулярной массой 18,5 КДа, По литературным данным К99

5 антиген Escherichla coll имеет молекулярную массу 18,5 КДа. Полученные моноклональные антитела будут использованы в

ИФА для диагностики колибактериоза.

Формула изобретения

10 Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus МозсоЬз L — BCKK (П) Q

519 0-продуцент моноклональных антител к

К99 адгезивному антигену Escherlchla coll,