Способ консервирования эритроцитов

 

Изобретение относится к криобиологии. Целью изобретения является повышение качества целевого продукта за счет снижения токсичности при его использовании. Эритроциты замораживают в два этапа: на первом до температуры кристаллизации консервируемой среды, на второй со скоростью 30 - 100°С/мин до (-170) (-180)°С. Замораживание осуществляют в среде, содержащей, мас. 1,2-пропандиол 20 26; поливинилпирролидон ( мол.мас. 11090)8 12; хлористый натрий 0,5 0,9; вода бидистиллированная остальное. 6 табл.

Изобретение относится к криобиологии, а именно к низкотемпературному консервированию эритроцитов человека, и может быть использовано на станциях переливания крови. Известен способ консервирования эритроцитов под защитой глицерина. Однако этот способ требует нескольких отмывок из-за его высокой токсичности, в результате чего большое теряется количество (до 10%) клеток. Наиболее близким к заявляемому является способ консервирования эритроцитов, согласно которому их замораживают со скоростью 1214^оC/мин до (-150)-(-170)^оС в среде, содержащей 37% 1,2-пропандиола (1,2-ПД), сахарозу, хлористый натрий и воду бидистиллированную, затем погружают в жидкий азот и хранят при -196^оС. После размораживания их отмывают одноэтапно и ресуспендируют. Недостатком этого способа является то, что после отмывки в эритромассе остается достаточно большое количество 1,2-ПД (около 1,5%), что не позволяет переливать большие объемы крови. Целью изобретения является повышение качества целевого продукта за счет снижения токсичности при его использовании. Способ осуществляют следующим образом. Эритроциты центрифугируют при 35000 об/мин (2050g) в течение 15 мин и удаляют надосадок и слой лейкоцитов. Смешивают (1: 1) c криоконсервирующей средой, содержащей, мас. 1,2-ПД 20-26 ПВП-11090 8-12 NaCl 0,5-0,9 Вода бидистил- лированная Остальное Через 15 мин эритровзвесь центрифугируют при 35000 об/мин в течение 15 мин, удаляют супернатант и слой лейкоцитов. Эритроцитную массу помещают в контейнер и охлаждают до температуры кристаллизации консервирующей среды (-14)-(-16)^оС. Охлаждение на первом этапе должно осуществляться медленно (не выше 2^оС/мин), так как чем ниже скорость охлаждения, тем при более высокой отрицательной температуре можно получить кристаллы льда в образце. Достигнув температуры кристаллизации, выдерживают 10-15 мин и замораживают со скоростью 30-100^оС/мин (-170)-(-180)^оС, затем погружают в жидкий азот и хранят при -196^оС. Отогревают сначала до (-80)-(-110)^оС со скоростью 10^оС/мин, а затем со скоростью 80-100^оС/мин. Размороженные эритроциты отмывают одноэтапно для чего их суспендируют в среде N 1 (1:1), содержащей 10% сахарозы, 1,5% NaCl и воду бидистиллированную, а затем добавляют среду N 2, (1:1), содержащую сахарозу, 0,9% NaCl и воду бидистиллированную. После центрифугирования и удаления надосадка эритроциты ресуспендируют во взвешивающем растворе ЦНИИГПК-8в. П р и м е р 1. К 125 мл эритромассы приливали 125 мл консервирующей среды, содержащей, мас. 1,2-ПЛ 20 ПВП-11090 10 NaCl 0,5 Вода бидистил- лированная Остальное Через 15 мин центрифугировали при 2050 g 15 мин. Надосадок и слой лейкоцитов удаляли, а эритромассу объемом 120 мл переливали в контейнер и охлаждали со скоростью 1^оC/мин до -16^оС и выдерживали при этой температуре 10 мин. Затем образцы замораживали со скоростью 30^оС/мин до -170^оС и переносили в жидкий азот, где хранили при -196^оС. Отогревание контейнера осуществляли со скоростью 10^оС/мин до -110^оС. Затем переносили в водяную баню с температурой 42^оС на 100c (80^оС/мин). К эритромассе добавляли (1:1) раствор N 1, затем раствор N 2. Поле центрифугирования и удаления надосадка к эритромассе добавляли (1:1) раствор ЦНИИГПК-8в. Сохранность эритроцитов определяли по гемолизу, который составил 96% Концентрацию остаточного 1,2-ПД определяли методом ЯМР (0,73±0,14%). П р и м е р 2. Способ осуществляли в соответствии с примером 1, за исключением того, что консервирующая среда содержала различную концентрацию 1,2-ПД. Результаты представлены в табл. 1. Из табл. 1 видно, что при концентрации 1,2-ПД выше 26% и ниже 18% увеличивается гемолиз эритроцитов, что свидетельствует о низкой сохранности эритроцитов. Следовательно, среду с такими концентрациями 1,2-ПД нельзя применять для достижения поставленной цели. П р и м е р 3. Способ осуществляли в соответствии с примером 1, за исключением того, что в консервирующей среде варьировали концентрацию ПВП-11090. Результаты представлены в табл. 2. Из табл. 2 следует, что оптимальная концентрация ПВП в среде 12% При уменьшении концентрации ПВП возрастает гемолиз, а при увеличении наблюдается агломерация эритроцитов. П р и м е р 4. Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что для замораживания использовали среды, одна из которых содержала максимальные концентрации компонентов, другая минимальные, третья и четвертая запредельные. Результаты представлены в табл. 3. Из табл. 3 видно, что при использовании среды с концентрациями компонентов ниже заявляемых резко возрастает гемолиз эритроцитов, а при более высоких концентрациях происходит их агломерация. П р и м е р 5. Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что изменяли температуру охлаждения на первом этапе. Из табл. 4 видно, что замораживание на первом этапе до температур выше или ниже температуры кристаллизации среды приводит к увеличению гемолиза. П р и м е р 6. Способ осуществляли аналогично примеру 1, за исключением того, что изменяли скорость замораживания на втором этапе, результаты представлены в табл. 5. Из табл. 5 следует, что оптимальная скорость охлаждения на втором этапе до 110^оС/мин. При повышении или понижении скорости гемолиз возрастает. Использование в консервирующей среде ПВП-11090 вместо сахарозы и новый режим замораживания позволяют снизить концентрацию ПД в среде и соответственно снизить концентрацию остаточного ПД в консервированных эритроцитах, не понижая при этом уровень сохранности клеток. Таким образом, заявляемый способ позволяет снизить концентрацию остаточного 1,2-ПД в консервированных эритроцитах на 20-40% не снижая их сохранности. Это дает возможность использовать криоконсервированные эритроциты для трансфузий в больших объемах.

Формула изобретения

СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ, включающий отделение плазмы, добавление к эритроцитам консервирующего раствора, содержащего 1,2-пропандиол, хлористый натрий, бидистиллированную воду, центрифугирование с последующим замораживанием осадка при (-150) (-170)^oС, хранением в жидком азоте, отогреве и отмывании при использовании, отличающийся тем, что, с целью повышения качества целевого продукта за счет снижения токсичности при его использовании, консервирующий раствор содержит 8 12 мас. водного раствора поливинилпирролидона (мол. м. 12000 ± 2700), 20 26 мас. 1,2-пропандиола, 0,5 0,9 мас. хлористого натрия, а замораживание проводят вначале со скоростью 1^oС / мин до (-16)^oС, затем со скоростью 30 - 100^oС / мин.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Номер и год публикации бюллетеня: 31-2000

Извещение опубликовано: 10.11.2000        

---