Штамм бактерий вrеviвастеriuм lастоfеrмеnтuм-продуцент лизина

 

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: штамм бактерий Brevibacterium lactofermantum HHTHA-88R получен генетико-селекционным путем из штамма Brevibacterium lactofermentum НИ- ТИА-88. Штамм устойчив к бактериофагам, лизирующим Культуры Brevibacterium lactofermentum. При выращивании на традиционных средах при 30° - 32° и рН среды 7,0-7,4 в течение 66 часов проявляет активность до 62 г/л лизина, что соответствует конверсии по использованному сахару 48%. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л С 12 N 1/20, С 12 P 13/08

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ тантов, устойчивых к фагу BIA 2 и выбор варианта с наибольшей лизинпродуцирующей активностью. (21) 4912375/13 (22) 27.12,90 (46) 15,01.93. Бюл. М 2 (71) Малое научно-производственное предприятие "Фармаген" (72) М.Б.Читчян, С.В,Кажоян, Г.Г,Оганезова.

Э.Л.Агабекян, В,А,Саканян, М.В.Есаян, С.E.Ìîâñåñÿí и В.С.Аветисян (56) Авторское свидетельство СССР

N1678053,,кл. С 12 N 1/20, 1989. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BREVIBACTERIUM

LACTOFERMENTUM — ПРОДУЦЕНТ ЛИЗИНА

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к получению лизина микробиологическим путем с помощью нового штамма-продуцента вида В lactofermentum.

Лизин широко используется в народном хозяйстве — медицине и пищевой промышленности, сельском хозяйстве.

Известен штамм-продуцент лизина

В factofermentum НИТИА-88. синтезирующий до 62 г/л лизина. За время применения штамма в крупномасштабном производстве лизина на Чаренцэванском ОПЗ "Лизин" в течение двух лет были выявлены три бактериофага, лизирующие культуру

В Iactofermentum НИТИА-88: BIA 1. BiA 2 и

BIA 3. Подверженность штамма-продуцента лизису этими фагами приводила к снижению выхода лизина в ферментерах. что отрицательно сказывалось на экономических показателях завода.

Поэтому целью изобретения является создание на основе штамма

В Iactofermentum НИТИА-88 нового проду„„Я „„1788011 Al (57) Использование: биотехнология, Сущность изобретения: штамм бактерий

Brevibacterium lactofermentum НИТИА-88R получен генетико-селекционным путем из штамма B revibacterium lactofe rmen turn Н ИТИА-88. Штамм устойчив к бактериофагам, лизирующим культуры Brevibacterium

Iactofermentum. При выращивании на традиционных средах при 30 — 32 и рН среды

7,0-7,4 в течение 66 часов проявляет активность до 62 г/л лизина, что соответствует конверсии по использованному сахару 48 .

1 табл. цента, устойчивого ко всем выявленным в промышленных условиях фагам и не уступающего по активности родительскому штамMу.

Штамм-продуцент В.lactofermentum и

НИТИА-88R получен на основе штамма

В.lactofermentum НИТИА-88 путем много- Ор ступенчатой селекции по следующей схеме:

Штамм В Iactofermentum НИТИА-88 отбор спонтанных, устойчивых к фагу BIA 1 мутантов и выбор варианта с наибольшей лизин продуцирующей активностью, Штамм В lactofermeritum НИТИА-88-1 отбор спонтанных му1788011

Штамм B. Iactofermentum Н ИТИА-88-2 отбор спонтанных мутантов, устойчивых к фагу BIA 3 и выбор ва- 5 риэнта с наибольшей лизин продуцирующей

aKTMBHOcTbIo, Штамм В,lactofermentum НИТИА BBR, Отбор фагоустойчивых вариантов проводят I".à чашках с агаризованной питательной средой одновременным высевом фага в титре не менее 10 фаговых частиц/мл и т суспензии бактериальной культуры. Установлено, что частота возникновения спонтанных мутантов, устойчивых к фагам BIA 1, BIA 2, BIA 3 у штамма В.lactofermentum НИТИА-88 высокая (на уровне 4 10, 2 10 и 20

5 10 соответственно). Поэтому бактериальную суспензию наносят нэ чашки в титре

10 — 10 кл/мл. Выросшие колонии на каждом этапе селекции после трехкратной проверки на устойчивость к фагу проверяют на лизинпродуцирующую активность.

Штамм В.lactofermentum НИТИА-BBR депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под коллекционным номером В-5453, ЗО

Морфологическая характеристика штамма В.lactofermentum НИТИА-BBR.

Клетки штамма В,lactofermentum НИТИА-BBR овальные, спор не образуют, неподвижные, окрашиваются по Граму, При росте на твердой синтетической среде на четвертые сутки образует колонии кремового цвета диаметром 1,5 — 2 мм, на агаризованной мясо-пептанной среде на вторые— третьи сутки образует колонии кремового цвета диаметром 2-3 мм. При посеве штрихом на вторые сутки наблюдается умеренный рост культуры. Суспензия клеток в бульоне и физиологическом растворе равномерная, без поверхностной пленки и осадка, Физиолого-биохимические свойства.

Штамм аэробный, хорошо растет при температуре 29 — 35 и имеет оптимум рН среды для роста 7-8: 50

Отношение к источникам углерода. Утилиэирует глюкозу, сахэрозу, лактозу, маннозу, ксилозу, уксусную кислоту, этанол.

Отношение к источникам азота. Использует нитраты. мочевину, соли аммония, аминокиглаты.

Штамм эуксотрг фен па серину и лейцину, ну дэегся для роста в витаминах биоти не и тиамине, устойчив к S-2-аминозтил-1цистеину.

Отношение к фагам. Штамм устойчив к фагам В1А 1, BIA 2 и В1А 3, выделенным в крупномасштабном производстве лизина на Чаренцаванскам ОПЗ "Лизин".

Использование штамма-продуцента

В.lactofermentum НИТИА-BBR иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Ферментацию штаммов

В.lactofermentum НИТИА-BBR u

В,lactofermentum НИТИА-88 (в качестве контроля) проводили в отдельности в присутствии фагов В!А 1, В1А 2 и BIA3 и комбинации фагов в 750 мл колбах Эрленмейера в 20 мл среды состава: меласса 12,5 / (по содержани о редуцирующих веществ — ПВ}, сернокислый гидролизат пэприна 1,5 (по сухому весу паприна), МН4С1 0,9 /, (МН4) 504 1 /,, (М 1-1 )2Н Р Оа 0,1 /, мел 2 /, рН среды 7,2 — 7,4, В качестве посевного материала использовали культуру штаммов, выращенных в течение 20 ч на следующей среде: меласса 3 /, (по содержанию РВ), гидролизат паприна 0,3 (по сухому весу паприна), мел 2 /,. Посевной материал вносили в количестве 10 /. Одновременно вносили лизат отдельных фагов или их комбинаций (начальные титры фагoeblx частиц указаны в таблице). Ферментацию проводили при температуре 30,в течение 66 ч. В конце ферментации определяли оптическую плотность культуральной жидкости (ОП), выход лизина и титр фагов. Из таблицы видно, что при одновременном культивировании штамма В.lactofermentum НИТИА-BBR c фагами титр последних заметно сни>кается, что свидетельствует о неадсорбционной природе мутаций, обеспечивающих фагорезистентность продуцента, Новый штамм по своей лизирующей активности не уступает родительскому штамму B.lactofermentum

НИТИА-88 (см,табл.).

Пример 2. Посевной материал штамма

В.lactofermentum НИТИА-BBR выращивали в 750 мл колбах Эрленмейера в течение 24 ч в 100 мл среды следующего состава: меласса 2 / (no содержанию PB), гидролизат папринэ 1,3% (по сухому весу паприна), NHканию аммонийного азота}, мел 2 " . 500 мл посевного материала вносят в два ферментера обьемом 10 л, содержащие по 4,5 л питательной среды состава: меласса 12 / (по содержанию PB), гидролизат папринэ 2 / (по сухому весу паприна). ИН4С1 0,5 / (из расчета содержания аммонийного азота), (NHq)zHPOd 0,1 /, тиаминэхлорид 0,01 мг /,, дестиобиотин

0.01 r, Ферментацию проводят при 301788011

25 ментациях выход лизина не превышал

20 г/л.

Таким образом, новый штамм-продуцент В Iactofermentum НИТИА-88R является более технологичным благодаря признаку устойчивости к выделенным в производственных условиях фагам. Эта характер стика нового фагочувствительного штам .а В.lactofermentum НИТИА-8SR диктует необходимость его внедрения в производстве лизина.

Формула изобретения

Штамм бактерий B rev ibacterium

lactofermentum ВКПМ В-5453 — продуцент лизина, 45

Выход лизина, рост культуры и титр фага при ферментации tlJTaMMoa В.lactofermentum НИТИА-88 и В,lactofermentum НИТИА-88R в присутствии отдельных фагов BIA 1, В(А 2 и BIA 3 и их комбинаций.

31", рН среды 7,4-7,6 в периодическом режиме с подпиткой.

По мере вспенивания ферментационной среды добавляют пеногаситель — пропинол Б 400. Подпитку проводят питательной средой состава: меласса 30/ (по содержанию РВ), гидролизат паприна

1,0/ (по сухому весу паприна), NH4CI 1,2/ (из расчета содер>кания аммонийного азота), (NH4)zl- РО4 — 0,1 /, тиаминахлорид 0,01 мг ; дестиобиотин 0,01 мг/, Питательную среду подают по достижении содержания редуцирующих веществ в ферментационной среде до 0,6 — 1,5/ со скоростью, обеспечивающей уровень РВ 1,2 — 1,3 . Через 20 ч ферментации в один из ферментеров вносят лизат фагов BIA 1, BIA 2, 8IA 3 в титре 1

1 10 каждого, Объем ферментационной среды в ферментерах к концу ферментации (через 70 ч) составляет 7 л. При этом в культуральной жидкости при ферментации

B.làñtîfåãmentum НИТИА-88R накапливается 72 г/л лизина, а в культуральной жидкости штамма В.iactofermentum НИТИА-88—

17 г/л.

Пример 3, Посевной материал штамма В.lactofermentum НИТИА-88R готовят, как описано в примере 2. В ферментер вместимостью 5 м вносят посевной материал в о ъеме 450 мл, При этом используется пи;. т льная среда в объеме 2,5 ч- 0,2 м слез ду ощего состава: меласса 3 / (по содержанию PB), гидролизат паприна 2,2/

leo сухомУ весУ папРина), Длительность феР" ации 24 ч при температуре 30:"2, Рас° >а подаваемого стерильного воздуха

2 . - >00 м . Полученный посевной материап, с," ° ржгн " ". .".. *" в кГ",е" г аи «

5,5: :. . .. в обьеме 2,5+ О,. :- .сят в ферментер вместимостью 50 м, содержаз щий 24 м питательной среды: следующего состава: меласса 10,2/ (по содержанию

PB), гидролизат паприна — 1,8 (по сухому весу паприна), NH4CI 0,6/ (из расчета со дер>кания аммонийного азота), (NH4)zHP04

0,05, пропинол Б 400 10 л. Ферментацию проводят в периодическом режиме при

30 +2, рН среды 7,3 +0,3 и расходе воздуха на аэрацию 1700-2400 м3/ч, Пеногаситель пропинол Б 400 а виде 15 эмульсии задают в ферментер по мере вспенивания культуральной жидкости: В процессе ферментации по мере снижения содержания РВ ниже 2 5 в ферментер дробно подают по 1,0 м подпиточной питательной среды состава: меласса — 20 / (по содержанию PB), МH4CI 1,3/ (по содержанию аммонийного азота), объем ферментационной среды в реакторе к концу ферментации составляет 30 м + 2. За это время в культуз ральной жидкости штамма

В.!ас1о1егmentum НИТИА-SSR накапливается 58 г/л лизина при коэффициенте конверсии 46,0/.

Новый фагоустойчивый штамм-продуцент лизина В,lactofermentum НИ ГИА-S8R был использован в реальных производственных условиях ЧОПЗ "Лизин". В процессе

20 ферментаций не было отмечено ни одного случая фаголизиса; выход лизина в производственных условиях колебался от 35 до

58 г/л (без учета ферментаций с технологическими нарушениями), В противоположность этому при ферментациях с применением фагочувствительного штамма

В, lactofermentum Н ИТИА-88 неоднократно

30 отмечены случая фаголизиса. При этих фер1788011

Продолжение таблицы

Со-.>яви>ель "1. 1итчян

Тепрел М М;ргентал Корректор Л. Филь

Редактор

Прг>извг>лсl»>,>It>c> >>летел> ский комбинаг Патент", г Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 537 1ор=..- Подписное

ВНИИПИ Государственнгно ко " итета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

11ЗОТз. Москва, Ж-35. Раушская наб., 4/5