Штамм бактерий bacillus suвтilis - антагонист возбудителей клебсиеллезов

 

Изобретение относится к микробиологии , а именно к созданию биопрепаратов, используемых для профилактики и лечения острых желудочно-кишечных заболеваний человека и сельскохозяйственных животных , вызванных бактериями рода Klebsiella. Целью изобретения является новый штамм Bacillus subtilic 945, обладающий высокой антагонистической активностью против возбудителей клебсиеллезов и характеризующийся абсолютной безвредностью для организма теплокровных . Штамм совершенно безвреден для теплокровных, является представителем нормального микробиоценоза человека и животных , оказывает ингибирующий эффект как в условиях отсроченного антагонизма , так и при совместном культивировании . 5 табл. С

союз соВетских

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 1/20, А 61 К 35/74

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ -":! !

«4

О

С

ЬЗ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4812569/13 (22) 15.02.90 (46) 07.12.92. Бюл. ¹ 45 (71) Институт микробиологии и вирусологии им, акад. Д.К.Заболотного (72) B.B.Ñìèðíoâ, А.И.Туряница, Н.В.Бойко . и B,А. В ьюни цкая (56) Заявка ФРГ ¹ 2010654, кл, А 61 К 35/74, 1981.

Авторское свидетельство СССР

N 1722502, кл. А 61 К 39/02, 1989.

Заявка Японии № 52-8382, кл, А 61 К 35/74, 1977.

Руководство по вакцинному и сывороточному делу. / Под ред. П.Н.Бургасова, М., 1978, с. 90. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ BACILLUS

SUBTILlS — АНТАГОНИСТ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ КЛЕБСИЕЛЛЕЗОВ

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при получении биопрепаратов, используемых для профилактики и лечения острых желудочнокишечных заболеваний человека и сельскохозяйственных животных, вызванных бактериями рода Kiebsiella.

Известно использование биопрепаратов на основе живых микробных культур, предназначенных для профилактики и лечения острых желудочно-кишечных заболеваний человека и сельскохозяйственных животных. Так, для профилактики и лечения острых желудочно-кишечных заболеваний человека используются микроорганизма Streptococcus facium штамм Gernelle Ы 1779692 А1 (57) Изобретение относится к микробиологии, а именно к созданию биопрепаратов, используемых для профилактики и лечения острых желудочно-кишечных заболеваний человека и сельскохозяйственных животных, вызванных бактериями рода

KlebsIella, Целью изобретения является новый штамм Bacillus subtilic N 945, обладающий высокой антагонистической активностью против возбудителей клебсиеллезов и характеризующийся абсолютной безвредностью для организма теплокровных. Штамм совершенно безвреден для теплокровных, является представителем нормального микробиоценоза человека и животных, оказывает ингибирующий эффект как в условиях отсроченного антагонизма. так и при совместном культивировании. 5 табл. № С1В 10415 (1); Bacillus licheniformis штамм N 31 и Bacillus subtilis штамм N. 3, предложенные в качестве основы препарата биоспорин (2). Bacillus cereus используется в качестве активного компонента лекарстве н ного и репарата, и редназначенного для лечения желудочно-кишечных заболеваний у жвачных животных (3). Однако описанные выше микроорганизмы не оказывают ингибирующего действия на бактерии рода Kbebsiella, Наиболее близким аналогом является представитель рода Bacillus, на основе которого получен выпускаемый югославской фирмой "Галеника" препарат бактисубтил, предназначенный для профилактики и лече1779692 ния дисбактеризов (4), Однако это средство, имеет ряд недостатков: микробная культура, входящая в состав бактисубтила, характеризуется невысокой антагонистической активностью и не проявляет ингибирующего действия на бактерии рода Klebsiella; нет достаточных данных об основных биологических свойствах и видовой идентификации микробной культуры, входящей в состав препарата бактисубтил, что не дает полной уверенности в его потенциальной безопасности для теплокровных.

Целью изобретения является новый штамм Basillus subtilis ¹ 945, обладающий высокой антагонистической активностью против возбудителей клебсиеллезов и характеризующийся абсолютной безвредностью для организма теплокровных.

Штамм бактерий Bacillus subtiils № 945 получен при изучении микробиоценоза желудочно-кишечного тракта здорового теленка 10-дневного возраста. Штамм выделен из посевов содержимого толстого кишечника, Пробы высевали на средах Гаузе

N. 2, сусло-агар (СА) и Громыко, Дальнейшее культивирование штамма осуществлялось в лаборатории общепринятым методом — выращиванием на скошенных агаризованных средах. Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов "ВНИИГенетика" и имеет коллекционный номер В-5225, Штамм ВасИЬэ subtilis ВКПМ N B-5225 имеет следующие признаки: граммположительные, аэробные спорообразующие подвижные палочки, образуют эндоспоры, не раздувающие клетки; расположение спор— центральное. Размеры клеток: (2,7-2,9)х х(0,8-0,9) мкм, При культивировании штамма на среде Громыко (мясопептонный агар (МПА) СА, 1:1) в течение 24 ч при 37 С образуются колонии плоские матовые, белые с кремовым оттенком, шероховатые, края колонии перистые. При культивировании на

МПА колонии плоские, кремового цвета, блестящие, края колонии перистые, с агара легко снимаются петлей. При культивировании мясопептонный бульон (МПБ) в стационарных условиях при 37 С образуется пленка на поверхности и наблюдается незначительное помутнение среды, При выращении в условиях аэрации на качалках при

200 об/мин на МПБ и жидкой среде Гаузе

N. 2 происходит общее помутнение среды.

Штамм — аэроб, хемоорганотроф, продуцирует каталазу, не растет в анаэробных условиях, после роста на глюкозном агэре протоплазма не содержит включения поли-P-оксимасляной кислоты. Редуцирует

10

40

45 зультаты исследований (величина зоны тор55

35 нитраты, не образует гэз в анаэробных условиях на среде с нитратами, не продуцирует сероводород и индол. Разжижает желатину, не разлагает мочевину, гидролизует крахмал. Штамм растет при температуре от 10 до 45 С. Температурный оптимум—

37 С. Растет при наличии в среде 5% хлористого натрия и не растет при 10% содержании NaCI e среде. Утилизирует глюкозу, ксилозу, арабинозу, маннит и пропионат.

Реакция Фогес-Проскауэра положительна.

Штамм не обладает лецитиназной активностью, не нуждается в витаминах и аминокислотах — дополнительных факторах роста, непатогенен для теплокровных. Маркерный признак: высокочувствителен к левомицетину, канамицину, эритромицину; устойчив к ампициллину, полимиксину. Культура пересевается на среде Громыко, Среда стерилизуется при 2 атм в течение 30 мин рН 7, температура хранения 20-22 С, срок хранения 3 мес. Хранение культуры осуществляют под минеральным маслом на среде

Громыко, рН 7, температура хранения 2022 С, срок хранения 1 год. Хранение культуры в сублимационно-высушенном состоянии: среда для выращивания — среда

Громыко, рН 7, срок выращивания на протяжении 4 сут, Состав суспензионных сред: NaCI 0,85 г; желатина 1 г, сахароза

4 г, дистиллированная вода до 100 мл. Режим высушивания от-20 до+30 С. Температура хранения 20-22 С. Срок хранения 5 лет.

Пример 1. Антагонистические свойства штамма Bacillus subtilis, Способность штамма Bacillus subtilis

ВКПМ №В-5225 ингибировать рост бактерий рода Klebsielià проверяют методом отсроченного антагонизма. Штамм культивируют на питательной среде Гаузе N. 2 в течение 48 ч. Для сравнения апробируют другие штаммы Bacillus subttiis из числа активных антагонистов, Затем культуры клеббсиелл подсевают методом штриха. Реможения, выраженная в мм) представлены в табл, 1. Все полученные данные носят статистически достоверный характер (при а= 0,95). Как видно из представленных в табл. 1 данных, антагонистическое действие исследуемых штаммов было проверено по отношению к 366 культурам Klebsieila

pneumoniae. К!еЬз!еИа ozaenae, Klebsielia

rhlnoscIermatis (клинические и музейные штаммы). Установлено, что более активными из бацилл оказались штаммы N 945

ВКПМ ¹8-5225, № 1108, N 1119, Однако штамм Bacillus sibtiiis 945 ВКПМ N.В-5225 в наибольшем числе случаев проявлял высокий уровень антагонистической активности, 1779692

Из числа исследованных 88 культур клебсиелл пневмонии, риносклеромы и озены оказались особенно высоко чувствительными к

Bacillus subtilis ВКПМ N.Â-5225 (эона задержки роста достигала 30,2-32,3 мм), в то время, как аналогичный показатель ингибирующего эффекта у штаммов 1108 и 1119

Basillus subtilis наблюдался соответственно для 68 и 61 культуры. Таким образом, наиболее активным антагонистом клебсиелл оказался штамм Bacillus subtilis 945

BKllM МВ-5225.

Штамм lP-5832 (прототип) вовсе не обладает противоклебсиеллезным действием, Выраженное подавление клебсиелл, осуществляемое живой культурой Basillus

subtilis ВКПМ N Â-5225, отмечают и при совместном культивировании этих видов микроорганизмов в жидкой питательной среде

Гаузе М2, Отмечено, в частности, что подавление роста клебсиелл регистрируется уже на 2-е сутки опыта. Максимальный ингибирующий эффект получен при дозе штамма

50 млн, микробных тел/1 мл. Кроме того. следует подчеркнуть, что торможение отмечается и в тех случаях, когда вносимое количество КОЕ тест-культур значительно превышает содержание штамма. Таким образом опыты, проведенные iè vitro, свидетельствуют о том, что антагонистическое действие штамма Bacillus subtilis ВКПМ

1ч.В-5225 по отношению к различным штаммам клебсиелл намного превышает антагонистическую активность всех других испытанных штаммов бацилл. в том числе коллекционых и штамма IP-5832 (прототип).

Важным преимуществом штамма

Bacillus subtilis ВКПМ N.Â-5225 перед штаммом-прототипом является его абсолютная безвредность. Проведено срванительное исследование патогенности штамма Bacillus subtilis BKllM и штаммапрототипа Bacillus sibtilis IP-5832 (табл.

2,3.4), Проводят исследование:

1, Суспенэии штамма Bacillus subtllis

945, выращенного на мясопептонном агаре при 37 С в течение 24 ч.

2. Фильтрата культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis 945, выращенного в течение 10 сут на мясопептонном бульоне при 37 С.

Проверку патогенности осуществляют на белых мышах весом18-20 г. Животным вводят суспенэии и фильтраты в желудок через зонд и в иньекциях.

Все мыши, получавшие культуру и фильтрат штамма Bacillus subtilis ВКПМ

N В-5225, оставались здоровыми на протяжении срока наблюдения.

В этот период они были активны, хорошо поедали пищевые рационы, физиологические отправления у них не нарушались, поведенческие реакции были обычными, изменений со стороны шерстного покрова не отмечалось. Динамика изменения массы тела животных в опыте и контроле было сходной. Все подопытные животные после окончания срока наблюдения были умерщвлены, вскрыты и их органы подвергнуты макроскопическому изучению.

Результаты вскрытия.

Сердце обычной формы и величины, у подопытных животных такое же, как и у контрольных.

Легкие по объему, строению долей у подопытных и контрольных животных одинаковые, поверхности легких гладкие, доли легко отделяются друг от друга. спаек не отмечено, Желудок, петли тонкого и толстого кишечника — внешне обычные, признаков воспалительных изменений не отмечено. При вскрытии просвета виден неизменный (такой же, как и у контрольных животных) рисунок слизистых.

Печень — темно-красного цвета, среднего кровенаполнения, не увеличена. Доли отделены друг от друга, поверхности гладкие, Почки по размерам и форме не отличаются у контрольных и опытных животных, поверхности гладкие. на разрезе виден четкий рисунок KopKoaolo Y. мозгового вещества.

Селезенка не увеличена, обычной консистенции. На разрезе пульпа умеренно полнокровна, темно-красного цвета, Таким образом, введение суспензии живых клеток 24-часовой культуры Bacillus

subtilis ВКПМ N В-5225 внутрибрюшинно и перорально в дозах 1-5 млрд. микробных клеток на мышь не вызывало у животных каких-либо признаков заболевания. Изучение внутренних органов животных не выявило у них патологических изменений, регистрируемых макроскопически.

Введение мышам фильтратом культуральной жидкости штамма не выявило у животных патологического процесса, регистрируемого клинически или при макроскопическом изучении внутренних органов животных.

Пример 2. Антиклебсиеллезное действие штамма Bacillus sibtilis ВКПМ

N В-5225 проверяют в опытах на лабораторных животных. С этой целью осуществляют проверку профилактического действия культуры Bacillus subtilis ВКПМ МВ-5225 на течение и исход экспериментальной ин1779692,?333н валерики роста, нн

0!таин

Baczttus

subzilis

КlеЬзгеllа nzaenae слабо чувст- чувстаит. вительн. 21-25 !

5-20 гЫлозс1еглас1в чувствит. высоко чув21-25 ствительн, 26 и еыае

:lebsiella слабо чутстаительн. !

5-20

IItebsiutla pneus3nniae слабо чувст- чувств. высоко чуавительн. 21-25 стеительи.

15 "20 26 и выев высоко чувстеительн.

26 и ныне

26,0 ь 1,2

27,32 1,9 — г —

23,7 : 0,6

26,7 1,8

21,S6 1,6 и —

21,0+ 0,8 и

15,28 2,2

15,0" 1,7

1) 15,1+ 1,4 и

17,n + 1,0

ЗТ

z4,9a t S

20,Р 61,2

924

30,1+ 2, 3

21,Э В 1,6

ЗВ

26,5 1,8! II

26,8+ 1,7 6т !

20,3 0,4

3Ъ

25,0+ 2,4

931

ZS,4+ З,З

27,4 6 1,4 гГ

30,2+ 1,2

24,4.ь 2,2

15,4 1,9

23 Г

19,4+ 1,3 гт

28,42 2,1

2). 4+ 1,8 — !ч

t5,4 + г 7 3 t)!

6 8+1,1

20,82 1,2

28,4+ 2.9

1Э

16,70 2,5 — 6т

22,10 1,2

21,4+ 0,6

25,0+ 1,9

934

29.36 3,2 гТ

22,90 1,6

22,0+ 1,8

63. 26,9ь 1,4

23,941,н

3 Г

24,4 3 1,8 зэ

22;tz 3,4

3Г

21,- z 3,0 -33 п 3 ° 3,3

18, 30 1.9 и

940

20,0 " 1,8

32,38 2,7 г5

З1,З. I,S

27,4е 2,7 — Т7 —

20,2+ 1,9

В КВт!

КВ-5225 (945) 25,0+ 4,2

24,8+ 3,4

23,6+ 2,5 — тт

31,3 - 3,2 — Т8—

29,4- 2,6 — т —

28,52 I.5 л

?Э,4 2,2 и

17,3 1,3

24,64 3,1

1S,7ь 1,3

Зб

19,1 + 1,1 68=

953

16,4 г О, \ Ь

16,76 1,6 58

18,1+ 2,2 — н

27,08 3,4

30,20 0,9 — тт —

15,0+ 1,4

3Г

17,8 + 1,6 зг —

23,0+ 2,2

26,7+ 1,9 — !г —

28,8+ 3,2

Т7

961

23,7 б 1,6

1106

20,4+ 2,6 и

19,9 + 2,6 д

1107.19,2 1,8

ЗК

20,6+ 1,5 гр

18,5 + 0,4

1!,6 з 2,4

22,2.3 3,3 — 1 —

27,7+ 1,6

26,0 0,6

30,263 0

24,3+ 0.9

25,0 b 1,9

21,0+ 2,2 в

2З,Э+ 1,7 3т

29,8 6 3,2! б—

30,1+ 4,t

7 Т8

24,5+ 2,9 32 2+ 2 4

I8,94 1,2 тг

1 10S

33 и

18,20 2,4 — !7= —

t 109

21,061,2 26,64 2,6

28,2 8 2,6 — 12—

26,1+ 1,4

13

29,42 2,2 а—

IЭ, 1+ 2,2 — 33

1S,5 0,3

20,8+- 1,9 т

25,0 + 2,3 43—

22,6+ 0,9

24,8+ 2,7  —

183+08

17,5+ 2,6 а

19,95 2,8

24,2 + 1,2

Ы вЂ”

29,6+ 2,2

15,5+ +1,1 — -тг —

19,02 0,6

78—

33 В

21,2+ 2,8 28,8 3- 1 2

1110

22,50 2,9

IIII

24,80 2,6 — ВГ—

27,3+ 0,8

29,8+ 1,6

1119 — тг—

1p"5832 р а и е. 8 числителе - зоне аадеркки роста бактерий а клеб и исследованных клебсиелл. и рода кле снелла, нм; в знаменателе - абсолзтное число етаммов

Таблица 2

Результаты исследования вирулентности культуры Bacillus subtllis ВПКМ N  — 5225, выращенной B течение 24 ч на мясопептонном агаре при 37 С фекции, вызываемой высоко вирулентной культурой Klebsiella pneumoniae штамм

3785. ЛД о названного штамма составляет

50 млн. КОЕ, Результаты изучения профилактического действия исследуемых культур бацилл при исследовании инфекционного клебсиеллезного процесса представлены в табл. 5.

Как следует из табл, 5, особенно выраженный противоклебсиеллезный профилактический эффект наблюдают при парентеральном введении штамма Bacillus

subtilis ВКПМ N B-5225 по сравнению с штаммом 1119, Несмотря на жесткие условия опыта (летательная доза инфекта составляет 60-100), сохранность животных составляет 80, 90 и 100%, Причем отмечается определенная коррелятивная зависимость между используемой суспензии микроба-антагониста штамм Bacillus

subtilis ВКПМ ¹B-5225 и эффектом профилактического действия по отношению к клебсиеллезной инфекцией, Так, при парентеральном введении одного млрд. клеток

5 антагониста процент сохранности составляет 90. Увеличение дозы Bacillus subtilis

BKRM ¹B-5224 до пяти млрд. обеспечивает

100% сохранность взятых в опыт животных, несмотря на то, что доза инфектора превы10 шает 100 .

Таким образом, опыты на животных подтверждают высокую противоклебсиеллезную эффективность штамма Bacillus

subtilis ВКПМ №В-5225, установленную в

15 опытах in vitro u его полную безвредность для теплокровных.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtilis В КПМ

¹B-5225 — антагонист возбудителей клеб20 сиеллезов, 1779692

Таблица 3

Результаты исследования вирулентности культуры Bacillus subtilis 1Р— 5832

Таблица 4

Таблица 5

Эффективность перентерального и перорального введения штаммов В. subtilis 1119 и

ВПКМ N.  — 5225 с целью профилактики зкспериментальной клебсиеллезной инфекции у

Рез льтаты опыта

Кол-во мышей в опыте

Доза инфекта

Доза и способ введения культур бацилл 4 сохранности пало выжило

Штамм 945 (ВКПМ N  — 5225)

1 млрд. внутрибрюшинно

10

ЛД60

Штамм 945 (ВКПМ ¹  — 5225)

1 млрд. перорально

ЛДбо

Штамм 1119 1 млрд. внутрибрюшин но

ЛДбо

10

Штамм 1119 1 млрд, перорально

ЛД60

Штамм 945 (ВКПМ N  — 5225)

1 млрд. внутрибрюшинно

Jln100

Штамм 945 (ВКПМ ¹  — 5225)

1 мл . пе о ально

10

Л 1оо

Результаты исследования токсигенности фильтрата культуры Bacillus subtilis ВПКМ № В—

5225 после роста на мясопептонном бульоне в течение 10 сут при 37 С

1779692

Продолжение табл. 5

Составитель В, Романова

Техред М.Моргентал Корректор С, Юско

Редактор Л, Волкова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101

Заказ 4417 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5