Рекомбинантная плазмидная днк pgcs1-39 с-концевых аминокислот вируса гепатита в, с экспонированным на его поверхности эпитопом р s1(20-68), способ ее конструирования и штамм бактерии е.coli - продуцент кор-антигена, лишенного 39 с-концевых аминокислот вируса гепатита в с экспонированным на его поверхности эпитопом ps1(20-68)

 

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, генной и белковой инженерии, биотехнологии . Целью изобретения является получение кор-антигена вируса гепатита В человека, не обладающего сродством к нуклеиновым кислотам, и, в конкретном случае, получение химерных белковых структур, экспонирующих на поверхности кор-антигена, лишенного 39 С-концевых аминокислот, фрагмент участка preSIHBV x 20 по 68-ю аминокислоту . Сконструирован рекомбинантный ген HBCAg A- preSI (20-68), кодирующий синтез соответствующего белка, плазмида pGCSI-140 для его экспрессии, а также штамм-продуцент E.coli/pGSI-140/ рекомбинантной капсидной структуры НВсАд Д- НВVpreS 1(20-68), обеспечивающий выход конечного продукта в количестве не менее 26,7% от суммарного белка. 3 с.п.ф-лы, 3 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4728572/13 (22) 10.08.89 (46) 15.06,92, Бюл. %22 (71) Институт органического синтеза АН

ЛатвССР (72) Г.П,Борисова, И.Г.Берзинь, 3.Я.Грен, В.Я.Лосева, В.П,Осе, Ю.А.Озолс, П.П.Пумпен, П.М.Пушко и В.В.Цибиногин (53) 575.224.2.577.2 (088.8) (56) Борисова Г.П. и др. ДАН СССР, 1984, т.279, с.1245.

Там же, 1988, т.298, с.1474 — 1478. (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

ДНК pGCS 1 — 140, КОДИРУЮЩАЯ КОРАНТИГЕН, ЛИШЕННЫЙ 39 С-КОНЦЕВЫХ

АМИНОКИСЛОТ ВИРУСА ГЕПАТИТА В, С

ЗКСПОНИРОВАННЫМ НА ЕГО ПОВEPXНОСТИ ЗПИТОПОМ pSI (20-68), СПОСОБ

ЕЕ КОНСТРУИРОВАНИЯ И ШТАММ БАКТЕРИИ Е.COLI — ПРОДУЦЕНТ КОР-АНТИГЕНА, ЛИШЕННОГО 39 С-КОНЦЕВЫХ

АМИНОКИСЛОТ ВИРУСА ГЕПАТИТА В С

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, генной и белковой инженерии, биотехнологии.

Целью изобретения является получение кор-антигена вируса гепатита В человека, не обладающего сродством к нуклеиновым кислотам, и, в конкретном случае, получение химерных белковых структур, экспонирующих на поверхности кор-антигена, лишенного 39 С-концевых аминокислот, фрагмент участка pre S1 HBV с 20-й по 68-ю аминокислоту, (s1)s С 12 N 15/48, 15/51, 15/10

ЗКСПОНИРОВАННЫМ НА ЕГО ПОВЕРХНОСТИ ЭПИТОПОМ pS I (20-68) (57) Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности, генной и белковой инженерии, биотехнологии. Целью изобретения является получение кор-антигена вируса гепатита В человека, не обладающего сродством к нуклеиновым кислотам, и, в конкретном случае, получение химерных белковых структур, экспонирующих на поверхности кор-антигена, лишенного 39 С-концевых аминокислот, фрагмент участка preSIHBV х 20 по 68-ю аминокислоту. Сконструирован рекомбинантный ген

HBCAg Л вЂ” preSI (20-68), кодирующий синтез соответствующего белка, плазмида ф

pGCSI-140 для его экспрессии, а также штамм-продуцент E.coll/pGSI-140/ рекомбинантной капсидной структуры HBcAg Л—

HBVpreSI(20-68), обеспечивающий выход конечного продукта в количестве не менее

26,7% от суммарного белка. 3 с,п.ф-лы, 3 табл.

Сконструирован рекомбинантный ген

HBcAg Л-pre S1 (20-68), кодирующий синтез соответствующего белка, плазмида

pGCSI-140 для его экспрессии, а также штамм-продуцент Е.coli (pGCSI-140) рекомбинантной капсидной структуры HBcAg ЛHBV preSI(20-68), обеспечивающий выход конечного продукта в количестве не менее

26,7% от суммарного белка Е,coli.

Рекомбинантная плазмида pGCS-140 состоит из следующих элементов; ДНК плазмиды рНВс 1315, которая представляет собой вариант плазмиды рНВс3, содержащей ген HBcAg с оптимизированным

1740418 участком инициации трансляции, но с мутантным геном HBcAg, содержащим полилинкерную вставку по 144-й аминокислоте и предназначенным для внедрения чужеродных последовательностей по этому уча- 5 стку, протяженность 6900 п.о.; фрагмент генома HBV из плазмиды рНВ320, соответствующий последовательности между сайтами рестрикции Mstll)gos и BamHlzp и кодирующий участок preSI (20-68) протя- 10 женностью 150 п.о.

Размер плазмиды 7050 п.о., мол,м. 4,5

МД.

В состав ДНК рекомбинантной плазмиды pG CS 1-140 входят следующие ген ы: ген 15

HBcAg h,-preSI (20-68), обеспечивающий синтез конечного продукта; ген bla, обеспечивающий устойчивость к ампициллину.

Ген Н BcAg Л-preSI(20-68) находится под контролем тандема праматоров Perp 20

Плазмида pGCSI-140 амплифицируется при добавлении в среду хлорамфеникола, неконьюгативна.

Сущность способа конструирования плазмиды pGCSI-140 состоит в том, что 25 фрагмент гена preSI, именуемый HBVpreSI (20-68), протяженностью 150 п.о. внедряют по сайтам рестрикции Clal (ïo кодону 144-й аминокислоты) в векторную плазмиду рНВс1315 с образованием рекомбинантно- 30 го гена HBcAg Л-preSi (20-68). В результате изменения рамки считывания вправо от внедренного фрагмента наводится терминирующий кодон и нуклеотидная последовательность, кодирующая 39 С-концевых 35 аминокислот HBcAg, не транслируется.

Штамм — и родуцент H BcAg Л -preS I (2068) получают трансформацией клеток Е.coli

К802 рекомбинантной плазмидной ДНК

pG CS I-140. 40

Морфологические признаки; клетки палочковидной формы, грамотрицательные, Культуральные признаки: клетки растут на обычно используемых питательных средах, образуют колонии средней величины, 45

Физико-биохимические признаки: оптимальная температура культивирования—

37 С, оптимум рН 7,0 — 7,4. В качестве источника углерода используют углеводы, в качестве источника азота — минеральные соли, а 50 также органические соединения в виде пептона, триптона, аминокислот, Устойчивость к антибиотикам: устойчив к ампициллину, что обусловлено наличием плазмиды. Присутствие в штамме плазмид- 55 ной ДНК подтверждается путем проверки устойчивости к ампициллину, а также путем выделения и анализа плаэмидных ДНК экспресс-методом.

Штамм депонирован в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-4975.

Пример,1. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pGCSI-140.

10 мкг плазмиды рНВс1315, выделенной стандартным методом, расщепляют 10 ед, рестриктазы Cia I в 25 мкл раствора А, содержащего 10 mM трис-HCI, рН 7,5, 50 mM

NaCI, 10 mM MgClz и 1 mM дитиотрейтол (ДТТ) в течение 2 ч. Рестриктазу инактивируют 15-минутным прогреванием при 65 С, После очистки на агарозном геле (на бумаге

ДЕ-81) известным методом фрагмент ДН К с мол.м, 4,42 МД(размером 6900 п.о.) растворяют в 20 мкл Н20 (ДН К 1)

50 мкг плазмиды рНВ 320, полученной очисткой на оксиапатите, расщепляют 25 ед. рестриктазы Bgl II и 25 ед. рестриктазы

Есо81 II (Mst II) в 250 мкл раствора Б, содержащего 10 mM трис-H CI, рН 8,5, 10 mM

MgClz и 1 mM ДТТ, в течение 3 ч при 37 С.

После очистки на агароэном геле известным методом фрагмент Вф II жз4 — Mstll>oos с мол,м, 0,4 МД (размером 626 п.о.) растворяют в 20 мкл HzO (ДН К 2).

2 мкг ДНК 2 расщепляют 2 ед рестриктазы Bam Hl в 20 мкл раствора А в течение

2 ч при 37 С. Фрагмент Bam HlzosaMstll egos размером 145 п.о. после очистки на

2 0 -ном агарозном геле растворяют в 10 мкл

HzO (ДНК 3).

Заполнение липких концов вектора и клонируемого фрагмента проводят совместно, для чего 0,1 мкг ДНК 1 и 0,05 мкг ДНК 3 инкубируютс 0,5ед, ДНП-полимеразы Е,coli (фрагмент Кленова) в 10 мкл раствора В, содержащего 50 m M т рис-Н CI, р Н 75, 10 m М

MgClz, 33,и M dATP, dCTP, dTTP и dGTP, в течение 1 ч при 12 С. ДН К-полимеразу инактивируют 15-минутным прогреванием при

65 С.

После заполнения липких концов зашивку вектора и клонируемого фрагмента проводят в 12 мкл раствора В сдобавлением

10 ед, Т4 ДНК-лигазы и ATP до конечной концентрации 500,и М в течение 12 ч при

4 С. К реакционной смеси добавляют 100 мкл клеток Е.соИ RRI, образованных 100 mM

CaClz (конечная концентрация 5х10 клеток/мл) для трансформации клеток путем рестрикционного анализа и секвенирования плазмидной ДН К, выделенной экспресс-методом, Плазмида с ожидаемой рестрикционной картой и нуклеотидной последовательностью получает наименование

pG CS I-140.

1740418

45

55

2. Штамм-продуцент Е.coli К802 (pGCSI140). Выделение и очистка рекомбинантного белка HBcAg h,-preSI (20-68).

Штамм-продуцент получают трансформацией клеток Е.coli К802 рекомбинантной плазмидой pGCSI-140, Клетки выращивают в солевой среде М9 с добавкой, г/л: казаминовые кислоты 10, глюкоза 2, ампициллин

0,02, до оптической плотности 4 — 5. Клетки собирают центрифугированием и лизируют в трехкратном обьеме буфера, содержащего

0,05 M трис-HCI, рН 8,0, 0,15 М NaCI, 0,1 тритон Х100, 0,005 М ЭДТА, при 4 С клетки подвергают трехкратному замораживаниюоттаиванию, добавляют дезоксирибонуклеазу и М9С!г до конечной концентрации 20 мкг/мл и 10 mM соответственно и инкубируют 30 мин при 4 С. Лизат осветляют центрифугированием (10 000xg, 4 С). HBcAg

Л-preSI(20-68) очищают следующим образом. Лизат подвергают фракционированию сульфатом аммония. HBcAg Л-preSI(20-68) собирают в осадке, полученном при 30 насыщения сульфатом аммония, Осадок растворяют в 0,04 М фосфате натрия, рН 8,0, 0,15 NaCI, 0,1 тритоне Х100 до конечной концентрации белка 25 — 50 мкг/мл, и 6 — 7 мл этого раствора наносят на колонку с Сефарозой CL4B (2,1х75 см), уравновешенную тем же буфером, но без тритона Х100. Фракции, проявляющие HBcAg-активность собирают и используют либо непосредственно, либо после концентрирования переосаждением 50 сульфатом аммония, 3. Определение НBcAg-активности методом РИД. . Титр HBcAg определяют с помощью радиальной иммунодиффузии.

Для этого готовят двукратные серийные разведения клеточного лизата и титруют против анти-НВс антител человека. В качестве стандарта используют очищенный

HBcAg, полученный из рекомбинантных бактерий (1 мг/мл), Результаты титрования активности методом РИД приведены в табл,1, 4. Определение preSI-активности методом иммуноблотинга. Мол,м, белка HBcAg

Л-preSI (20-68).

Для иммуноблотинга клетки (6 мг) суспензируют в 100 мкл буфера для нанесения образцов на полиакриламидный гель, содержащего 2 -ный додецилсульфат натрия (ДСН) и 2 -ный j3-меркаптоэтанол, и лизируют 2 мин прогреванием на кипящей водяной бане. Полученные лизаты (2 — 4 мг/мл белка) наносят на полиакриламидный градиентный гель (12 — 18 ) размером

150х150х0,75 мм. Электрофорез проводят в

35 течение 15 ч при силе тока 7 mA. После электрофореза белки переносят на нитроцеллюлозу. Фильтры инкубируют с моноклональными анти-preSI антителами мыши

MA18/7 в разведении 1:500 на буфере ТВ5, содержащем 50 трис-HCI, pH 7,8, 150 mM

NaCI, 0,1 тритон Х100, 1 БСА, в течение

15 ч при 20 С. После трехкратной отмывки буфером TBS фильтры инкубируют 2 ч при

20 С с конъюгатом пероксидазы с антителами против иммуноглобулинов мыши в разведении 1:200, Фильтры отмывают ТВ$ (3—

5 раз) и проявляют диаминобензидином.

Лизаты клеток штамма-продуцента обнаруживают при этом появление специфических зон окраски, соответствующих белку с мол.м. 23.,2 КД (или длиной 221 аминокислота), что соответствует схеме конструирования. Контрольйые лизаты клеток Е,coli К802 (рНВс3) таких зон не обнаруживают, 5. Электронно-микроскопическая характеристика рекомбинантных капсидных структур HBcAg Л-preSI(20-68), Препараты очищенного белка HBcAg h,-pre (20-68) готовят методом негативного контрастирования с применением 1 -ного уранилацетата и исследуют на электронном микроскопе при ускоряющем напряжении 80 кВ и инструментальном увеличении 100 000 раз, Белок НВсАд Л-ргeSI (20-68) образует капсиды диаметром 25 нм.

6. Определение preSI-активности в составе капсидных структур HBcAg Л-preSI(2068) методом энзимоиммунологического анализа на твердой фазе, В качестве твердой фазы используют полистироловые 96-луночные планшеты для иммунологических реакций, Очищенный белок HBcAg Л-pгe Sl(20-68) разводят до концентрации 10 мкг/мл в 50 mM МаНСОз— йа СОз рН 9,5 и вносят в лунки планшетов — по 100 мкл в каждую, Инкубируют 16 ч при

37 С, после чего раствор удаляют из лунок, планшеты высушивают. В лунки вносят Моноклональные анти-preSI антитела мыши

МА18/7 в разведении 1:5000 на буфере TBS.

После инкубации в течение 2 ч при 37 С планшеты отмывают 5 — 6 раз дистиллированной водой и вносят по 100 мкл коньюгата пероксидазы хрена с белком S.aureus в разведении 1;5000 на буфере ТВЗ. После инкубации в течение 1 ч планшеты отмывают и проводят цветную реакцию. В лунки вносят по 100 мкл 0,25 -ного раствора ортофенилендиамина,2HCI в 0,1 М цитрате натрия, рН 5,0, 0,02 Н О, инкубируют 30 мин при

20 С, реакцию останавливают добавлением

100 мкл 0,1 í.HCI. Появление коричневой окраски свидетельствует о наличии preSl1740418 активности. Для количественной оценки активности измеряют оптическую плотность при 492 нм и определяют величину Р/N (табл,2).

Отсутствие реакции в отрицательном контроле (HBcAg) свидетельствует о специфичности связывания анти-preSI антител рекомбинантными капсидными структурами HBcAg Л-preSI (20-68), 7. Иммуноэлектронная микроскопия капсидных структур с использованием коллоидного золота.

Капсиды HBcAg Л-preSI(20-68) сорбируют на никелевой сеточке, покрытой формваровой пленкой, в течение 15 мин, Сеточку промывают 0,5 мл раствора PBS, содержащего 0,05 Твин 20 (PBS-Твин 20), и инкубируют 15 мин в 0,03 мл 0,1 -ного раствора

БСА в воде, промывают 0,5 мл PBS-Твин 20, инкубируют 15 мин в 0,03 мл раствора моноклональных анти-preSI антител МА18/7 в разведении 1;10, промывают 0,5 мл PBSТвин 20, инкубируют 20 мин в 0,03 мл антител кролика против иммуноглобулинов мыши (в разведении 1;5), промывают 0,5 мл

PBS-Твин 20, Сеточку помещают на 1 ч в

0,03 мл раствора рА-Аи, содержащего белок

А, который конъюгирован с частицами коллоидного золота диаметром 8 — 10 нм, промывают 0,5 мл PBS-Твин 20 и затем 1 мл

Н20. Капсиды окрашивают методом негативного контрастирования 0,15 мл 2 -ного уранилацетата, Все операции выполняются при 20 С. В случае поверхностной локализации соответствующих эпитопов капсиды на электронной микрофотографии окружены венчиком частиц коллоидного золота. В качестве отрицательного контроля использованы капсиды HBcAg, не несущие эпитоп

preSI(20-68). Эти капсиды на образуют комплексов с коллоидным золотом.

8. Иммуногенная активность рекомбинантных капсид H BcAg Л-preSI(20-68).

Определяют иммуногенность, рекомбинантными капсидами HBcAg Л-preSI(20-68) иммунизируют кроликов. Для этого смешивают 2 мг антигена, растворенного в 1 мл физиологического раствора PBS, с 1,25 мл полного адъюванта Фрейнда и получаю гомогенную эмульсию. Антиген вводят под5

50 кожно. Инъекции антигена повторяют на 14й и 21-й день и с 28-ro дня начинают брать кровь, Специфичность антител определяют методом ИФА с использованием двух антигенов: HBcAg (для определения анти-НВс антител), fr-preS (белок оболочки PHK-фага

fr, несущий весь участок preS) — для определения анти-preSI антител.

Титры антител на 28 день иммунизации приведены в табл.3.

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК

pGCSI-140 размером 7049 п,о.(4,52 Mg),кодирующая кор-антиген, лишенный 39 С-концевых аминокислот вируса гепатита В, с экспонированным на его поверхности эпитопом pSI(20-68), содержащая: ДН К плазмиды рНВс 1315 размером 6900 п.о,;

Bam Н12щз — МзсИ 1908 фрагмент ДН К плазмимиды рН 6320 размером 149 п.о., кодирующего участок preSI(20-68) вируса гепатита В, уникальные сайты рестрикции и их координаты: BamHI(0), Sphl(191); Sall(276), Nrul(599), $па1(1871), Afl ill(2098), Psbl(3236), Seal(3471), Xbal(5176), гены, регуляторные участки ген HBcAg h,-pre Sl(20-68), обеспечивающий синтез рекомбинантных капсидных структур Н BcAg Л-pre S l(20-68) (координаты 5087-5722); тандем промоторов Perp, ген Ыа, обеспечивающий устойчивость к ампициллину координаты

2918-3778.

2, Способ конструирования плазмидной

ДНК pGCSI-140, заключающийся в том, что кодирующую последовател ьность участка

preSI размером 149 п,о, вырезают из плазмидной ДНК рНВ320 по рестрикционным сайтам ВатН!гоуз и Mstll egos с заполнением липких концов ДНК-полимеразой Е.coli u встраивают в плазмиду рНВс1315 по сайту

Clal за 144-й аминокислотой гена HBcAg, что приводит к терминации трансляции, трансформируют рекомбинантной ДНК штамм Escherichia coli и отбирают клоны,. содержащие целевую плазмиду.

3. Штамм бактерий Escherichia coli

В КПМ В-4975 — продуцент кор-антигена, лишенного, 39 С-концевых аминокислот вируса гепатита В с экспонированным на его поверхности эпитопом preSI(20-68).

1740418

Таблица 1

Синтез HBcAg Л вЂ” pre Sl (20 — 68) в бактериях Е,coll К802, несущих рекомбинантную плазмидную ДНК pGCSI — 140

Таблица 2

Иммунологическая активность рекомбинантных антигенов

Таблица 3

Иммуногенность химерных капсид HBcAg Л вЂ” preSI (20-68) Составитель С.Бандрин

Техред М.Моргентал Корректор О.Кравцова

Редактор Т.Лазоренко

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2051 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5