Способ определения концентрации меди и железа в грудном молоке

 

Использование: в аналитической химии и медицине при диагностике алиментарных анемий при дефиците в молоке кормящей матери биометаллов - железа, меди и др., являющихся гемопотическими факторами при гемоглобинообразовании. Сущность изобретения; анализируемую пробу молока депротеинезируют, обрабатывают смесью, метанола 30-35 об. % и хлороформа 65-70 об. %. и цветореагентом на каждый биометалл последовательно в одной пробе с последующим спектрофотометрированием окрашенных растворов. Время проведения определения 44 мин. 1 табл.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (si)s G 01 N 21/78

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР}

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛ ЬСТВУ (21) 4883735/04 (22) 05,10.90 (46) 23.02.93. Бюл, ¹ 7 (71) Научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови (72) А.А,Бугланов, Д.Н.Сулейманова и

А.Т,Тураев (56) .Методы практической биохимии. Под ред. Б.Уильямса и К.Уилсона. — M.: Мир, 1978, с, 166 — 171. ,Инструкция по применению коммерческого набора Био-Ла-Тест "Медь", БИО-ЛаТест "Железо", ЛАХЕМА, Ч СФ Р. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ МЕДИ И ЖЕЛЕЗА В ГРУДНОМ МОЛОКЕ

Изобретение относится к аналитической химии и медицине, а именно к способам количественного определения железа и меди в грудном молоке кормящей матери и может быть использовано при диагностике алиментарных анемий при дефиците в молоке кормящей матери железа и меди, являющихся гемопотическими факторами при гемоглобинообразовании.

Известен способ определения концентрации меди и железа в грудном молоке методом атомной-абсорбционной спектрофотометрии.

Недостатком способа является длительность определения из-за длительности подготовки пробы к анализу.

Наиболее близким к описываемому по технической сущности и достигаемым результатам является способ определения же„„ Ы„„1797921 А1 (57) Использование: в аналитической химии и медицине при диагностике алиментарных анемий при дефиците в молоке кормящей матери биометаллов - железа, меди и др., являющихся гемопотическими факторами при гемоглобинообразовании. Сущность изобретения: анализируемую пробу молока депротеинезируют, обрабатывают смесью, метанола 30 — 35 об. 7 и хлороформа 65-70 об. Д. и цветореагентом на каждый биометалл последовательно в одной пробе с последующим спектрофотометрированием . окрашенных растворов. Время проведения определения 44 мин. 1 табл. леза и меди в грудном молоке путем депротеинизирования анализируемой пробы отдельно для меди и отдельно для железа разными растворами с последующей обработкой депротеинизированных проб цветореагентами и спектрофотометрировэнием окрашенных растворов.

Недостаток способа тот же — длительность проведения определения.

Целью изобретения является сокращение времени определения.

Поставленная цель достигается описываемым способом определения концентрации железа и меди в грудном молоке путем депротеинизирования анализируемой пробы, обработки метанол-хлороформной смесью состава. 7ь объем метанол 30-35, хлороформ 65 — 70 и цветореагентом на каждый биометалл последовательно в одной пробе.

1797021

Отличительным признаком способа является обработка депротеинизированной пробы метанол-хлороформной -смесью состава, 7ь объем метанол 30 — 35, хлороформ

65-70 и определение биометаллов последовательно в одной пробе, Изобретение иллюстрируется следующим примером, Аликвоту молока (пробу) в объеме 1 мл дозатором переносят в чистую стеклянную центрифужную пробирку и подвергают депротеинизации добавлением 1 мл смеси для осаждения белков (концентрированная тиогликолевая кислота, трихлоруксусная кислота 0,6 моль/л, соляная кислота 2 моль/л). Суспензию тщательно перемешивают, затем центрифугируют при

3000 об/мин в течение 10 минут. Супернатант (надосадочную жидкость) отбирают при помощи дозатора в объеме 1 мл. переносят в чистый стеклянный сосуд с притертым шлифом и смешивают с 1 мл смеси метанол-хлороформ ("Реахим", хч) в соотношении 30 мл метанола и 70 мл хлороформа.

Далее эту суспензию интенсивно встряхивают в течение 2 мин и центрифугируют при

3000 об/мин в течение 10 минут. Экстрагированные липины и липопротеиды собираются на границе раздела двух фаз — плотной (хлороформ) и менее плотной (метанол), При помощи дозатора отбирают верхнюю фазу в обьеме 1 мл, переносят в чистую центрифу>кную стеклянную пробирку и смешивают сначала, с 1 мл реагента на медь (2, 9-диметил-4, 7-дифенил-1, 10-фенантролин-3, 6-дисульфонат). После смешивания пробу оставляют стоять в течение 5 мин, времени в течение которого развивается интенсивное желтое окрашивание (стабильное окрашивание сохраняется в течение не менее 1 ч после добавления реагента). Параллельно готовят аликвоты раствора сравнения и эталонного раствора. Раствор сравнения представляет собой смесь 1 мл бидистилли рованной воды и 1 мл смеси для осаждения белков. Эталонный раствор в процедуре определения меди представляет собой смесь 1 мл эталонного раствора, содержащего 30 мкмоль/л меди и 1 мл смеси для осаждения белков, Из 2 мл исходных растворов сравнения и эталонного отбирают по 1 мл каждого и смешивают их с 1 мл смеси метанол-хлороформ. После добавления смеси метанол-хлороформ пробы, содержащие раствор сравнения и эталонный раствор, центрифугируют при 3000 об/мин в течение 5 мин. При помощи дозатора отбирают верхнюю фазу в объеме 1 мл, переносят в чистую центрифужную стеклянную пробирку и смешивают с 1 мл реагента на медь, Оптическую плотность пробы и эталонного раствора измеряют против раствора сравнения в кварцевой кювете (длина светового пути 1 cM) на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 480 нм, Расчет концентрации меди в пробе молока производят по формуле

Х= — хС, А

10

45 в эталонный раствор железа. Раствор сравнения представляет собой смесь 0,5 мл бидистиллированной воды и 0,5 мл смеси для осаждения белков, а эталонный раствор—

0,5 мл смеси для осаждения белков и 0,5 мл эталонного маточного раствора. содержащего 17, 9 мкмоль/л железа. Раствор сравнения и эталонный раствор также подвергают обработке смесью метанол-хлороформ, после чего пробы содержащие эти

55 растворы центрифугируют при 3000 o5/мин в течение 5 мин. Дозатором отбирают верхнюю фазу в объеме 1 мл и добавляют последовательно сначала 1 мл реагента на медь и затем 1 мл реагента на железо, Оптическую плотность проб при определении содержания в них железа и эталона измеряют против раствора сравнения.

Расчет концентрации железа в пробе производят по формуле где X — содержание меди в пробе в мкмоль/л, А — оптическая плотность пробы, Б — оптическая плотность эталонного рас"5 твора, С вЂ” концентрация меди в эталонном растворе после обработки смесью метанолхлороформ в мкмоль/л, т, е. содержание меди в эталонном растворе с учетом разбавления маточного эталонного раство20 ра после обработки смесью метанол-хлороформ.

Время определения концентрации меди в пробе грудного молока, а также погрешность этого определения приведены в

25 таблице.

После определения содержания меди в этих же пробах проводят определение концентрации железа, для чего в каждую пробу добавляют по 1 мл реагента на >ке30 лезо (батофенантролин, т. е, 4, 7-дифенил-1, 10-фенантролин) и оставляют стоять не менее 5 мин. После развития интенсивной розовой окраски раствора измеряют оптическую плотность проб на

35 спектрофотометре СФ-26 в кварцевой кювете (длина светового пути 1 см) при длине волны 535 нм, Для расчета содержания железа в пробах параллельно готовят раствор сравнения

1797021

У= — х С х2.

А

Формула изобретения

Способ определения концентрации ме, ди и железа в грудном молоке путем депротеинезирования анализируемой пробы с последующей обработкой цветореагентами и спектрофотометрированием окрашенных

П р и и е ч а н и е: + — приведенные данные являются среднеотатистическов величиной от о исследование:

++ — разброс значение в 5 определенилк так велик. что выловит за границы достоверности.

Составитель С.Хованская

Редактор О.Стенина Техред М.Моргентал Корректор М.Максимишинец

Заказ 649 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101 где Y — - концентрация железа в пробе в мкмоль/л, А — оптическая плотность пробы, Б — оптическая плотность эталонного раствора, С вЂ” концентрация железа в эталонном растворе после обработки смесью метанол-хлороформ в мкмоль/л, 2 — коэффициент, компенсирующий разбавление проб и эталона за счет добавления 1 мл реагента нэ медь, Депротеинизурующую смесь для денатурэции белков молока готовят, смешивая 3 мл концентрированной тиогликолевой кислоты в мерной колбе емкостью.100 мл с трихлоруксусной кислотой в конечной концентрации 0,6 моль/л, содержащей также соляную кислоту в конечной концентрации

2 моль/л.

Цветореагенты на медь и железо в описываемомспособе используют в готовом виде из коммерческих наборов Био-Ла-Тест

"Медь" и нЖелезо". В отсутствии готовых цветореагентов их готовят следующим образом, на железо — в пробирке к 100 мг 4, 7-дифенил-1, 10-фенантролина (батофенантролина) добавляют 0,5 мл хлорсульфоно5 вой кислоты, нагревают на кипящей водяной бане в течение 30с. охлаждают и медленно приливают 10 мл воды, после чего снова нагревают на водяной бане 5 мин и разбавляют 100 мл дистиллированной воды.

10 Устанавливают рН 4,0, добавляя раствор 5 н. NaOH, и доводят объем дистиллированной водой до 200 мл. цветореагент на медь готовят аналогичным образом, только вместо 4, 7-дифенил-1, 10-фенантролина ис15 пользуется его производное — 2, 9-диметил-4, 7-дифенил-1, 10-фенантролин, Время определения концентрации железа в пробе грудного молока, а также погрешность этого определения приведены в

20 таблице, Суммарное время определения железа и меди по описываемому способу составляет 38 — 44 мин (по известному 80 мин) при той же чувствительности и точности..

25 растворов, отл ича ю щи и ся тем, что, с целью сокращения времени определения, 30 депротеинезированные пробы перед обработкой цветореагентом обрабатывают смесью метанола 30-35 об. и хлороформа

65 — 70 об. и определение железа и меди ведут последовательно в одной пробе,