"способ изготовления инактивированной концентрированной эмульгированной вакцины против болезни ауески (вакцина "бак")"

 

Использование ветеринарная вирусология . Сущность изобретения: вирус, размноженный в суспензионной культуре клеток до титра 8,0-9,0 Ig ТЦДбО/мл, инак тивируют формалином, концентрируют в 10- 30 раз ультрафильтрацией или полиэтиленгликолем, добавляют масляный адъювант в соотношении 1.1,5-1 2 и смешивают до образования стойкой эмульсии

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

PЕСГ1УБ"IИK

tst)s А 61 К 39/295

ГОСУДАРСТВЕ ННОГ rI4TFHTHOE

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СГCP) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (21) 5005317/13 (22) 17.10.91 (46) 15:06.93. Бюл. N. 22 (76) В.А. Сергеев (56) Наставление по применению инактивированной вакцины против болезни Ауески пушных зверей, свиней и овец. Утверждено

ГУВ MCX СССР 26.09.80.

Chappuis G., Fargeaud D., Brun А.

Vaccinat and Contr. AuJeszky s

Disease:Semin Commun. Programme Coord.

Agr. Res.á Brusseles. 5-6 July, 1988.

Dordrecht etc. 1989, р.67-78.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии. в частности к способам изготовления вакцин для специфической профилактики животных.

Целью изобретения является разработка способа изготовления инактивированной вакцины против болезни Ауески, обладающей высокой иммуногенностью.

Предполагаемый способ осуществляется следующим образом.

Вирулентные или аттенуированные (вакцинные, маркированные) штаммы вируса болезни Ауески (ВБА) размножают в суспензионной культуре постоянной линии клеток (линия клеток новорожденного хомяка — ВНК-21, линии клеток почки свинейППК, СПС, СПЭВ и др.) в ферментерах промышленного типа (100-2000 л) с использованием простой среды отечественного производства (ферментативный гидролизат мышечных белков. витамины группы В и глютамин) с 10 /, сыворотки крупного рогатого скота. Клеточную суспензию, содержа. Ы 1822345 А3 (54) СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННОЙ КОНЦЕНТРИРОВАННОЙ

ЭМУЛЬГИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ

БОЛЕЗНИ АУЕСКИ (ВАКЦИНА "БАК") (57) Использование: ветеринарная вирусология, Сущность изобретения: вирус, размноженный в суспензионной культуре клеток до титра 8,0-9,0 Ig ТЦДБо/мл, инактивируют формалином, концентрируют в 1030 раз ультрафильтрацией или полиэтиленгликолем, добавляют масляный адьювант в соотношении 1:1,5-1:2 и смешивают до образования стойкой эмульсии. щую 2,0-3,0 млн клеток в 1 мл, заражают при соотношении 1-10 ТЦД5о на 1 клетку. Сбор вируса производят через 30-68 ч. когда гибель пораженныхвирусом клеток достигает! у не менее 70%. При этих условиях выращнвания ВБА накапливается в титре 8,0-9,0 !

9ТЦц5о/MR. После инактивации В6A формалином (0,37,, 37 С, 72 часа) культуральную жидкость концентрируют в 30 раз (по объему) с помощью полиэтиленгликоля (мм.6000 Д) в гипертоническом растворе

NaCl или ультрафильтрацией. В обоих случаях инактивированную суспензию предварительно осветляют сепарированием, отделяют клеточный детрит. С целью освобождения связанного с клетками вирусного антигена фракцию клеточного детрита тщательно измельчают, пропуская дважды через коллоидную мельницу при минимальном зазоре (00) между трущимися поверхностями. При использовании ультрафильтрации концентрируют ос ветл ен ную жидкость. а затем к полученному концент1822345 рагу добавляют гомогенизированную фракцию клеточного детрита. В случае концентрирования инактивированного антигена

ПЭГ гомогенизированную фракцию клеточного детрита добавляют к осветленной фракции добавляют к осветленной фракции перед концентрированием, К смеси клеточной и бесклеточной фракции добавляют концентрированные стерилизованные ПЭГ (60 ) и NaCI (157,). Конечная концентрация

ПЭГ должна составлять 10, à NaCI — 1,57,, Суспензии тщательно перемешивают и оставляют для агрегации антигена на 16-18 ч при 2-6 С, а затем его осаждают сепарированием. К осадку антигена добавляют забуференный (1/15M) физиологический раствор, содержащий О.З формалина с таким расчетом, чтобы конечный объем составил 1. 30 объема исходной вируссодержащей культуральной жидкости.

К антигену ВБА, сконцентрированному в 30 раз (ультрафильтрацией или ПЭГ), добавляют стерильный масляный адъювант, состоящий из минерального масла ПЭС-3 (полиэтиленсилоксановая жидкость) 8284ф, и безводного ланолина 166-18 (по объему). На 1 ч. антигена берут 1,5-2 ч. (по объему) масляного адъюванта. Смесь антигена ВБА с минеральным адъювантам тщательно эмульгируют (при температуре

20-25 С) до образования стойкой гомогенной эмульсии. Эмульгирование проводят с помощью коллоидной мельницы или гомогенизатора промышленного типа, смонтированного в металлическом реакторе или ультразвукового эмульсора.

В табл,1 показано накопление ВБА в различных культуральных системах: в первичной культуре клеток почки свиньи (ПС), в суспенэии клеток трипсинизированной ткани куриных эмбрионов (КЭ), в суспенэии постоянных линий клеток новорожденного хомяка (линия ВНК-21) и почки свиней (лиHL1fl ППК).

Из В БА, выращенного в различных культурах, готовили образцы инактивированной формалином (0,3 ) ГОА — сапонин-вакцины.

Кроликам вакцину вводили внутримышечно двукратно по 5 мл с интервалом 2 недели.

Контрольное заражение кроликов (50

ТЦДо) проводили спустя 30 дней после начала иммунизации, Числитель — количество иммунных, знаменатель — количество зараженных животных.

Изданных табл.1 видно, что накопление вируса и иммуногенность вакцины были более высокими в случае использования для его выращивания суспензий перевиваемых клеток (ВНК-21 и ППК). концентрированием антигена ультрафильтрацией культуральную жидкость осветляли осаждая клеточный детрит сепарированием. После концентрирования к ультрафиль55 трату добавляли клеточный детрит, предварительно измельченный на коллоидной мельнице. При концентрировании антигена полиэтиленгликалем в гипертоническом растворе NaCI (êîíå÷íàÿ концентрация соответственна 10 и 2,3 ) 20

ЗО

В табл.2 показано накопление и иммуногенность двух производственных штаммов К и 6УК-668 ВБА. Вирулентный штамм К используют в биопромышленности для изготовления инактивированной вакцины (АрмНИИ животноводства и ветеринарии), а аттенуированный штамм BYK-668 применяли в производстве живой вакцины для сельскохозяйственных животных. Оба штамма вируса размножали в суспенэии клеток постоянной линии ППК, Из вируса готовили инактивированную формалином эмульгированную вакцину. Иммуногенность вакцины сравнивали на морских свинках (масса 300400 г), которых прививали подкожно в дозе

1 мл и заражали вирулентным штаммом К

ВБА (10г20 ЛД1оо для м.свинок) спустя 21 день.

Иэ данных табл.2 видно, что по накоплению в суспензионной культуре клеток ППК и иммуногенности аттенуированный и вирулентный штаммы ВБА не различались между собой, В табл.З приведены данные о целесообразности использования клеточного детрита после размножения В БА в суспензионной культуре клеток в качестве дополнительного источника вирусного антигена при изготовлении инактивированной вакцины. После максимального накопления

ВБА.в. суспензионной культуре клеток BHK21 вируссодержащую суспенэию разделили на 2 ч. Из одной с помощью центрифугирования удаляли клеточный детрит., другую оставляли без обработки. Из обеих частей вирусной суспенэии готовили инактивированную эмульгированную вакцину, иммуногенность которой испытывали на морских свинках, как описано выше.

В табл.4 приведены данные по значению степени концентрирования инактивированного В БА на иммуногенность вакцины.

Инактивированный вирусный антиген концентрировали в 5, 10, 30, 40 и 100 раз с помощью полиэтиленгликоля (молекулярная масса 6000 Д) или ультрафильтрацией через полые волокна или мембранные фильтры, задерживающие молекулы массой 15000Д диаметр nop < 10 нм).. Перед

1822345 обрабатывали неосветленную культуральную жидкость. К концентрированным двумя методами антигенам добавляли масляный адъювант, Иммуногенность инактивированной вакцины с различным содержанием инактивированного антигена ВБА сравнивали на м. свинках, который вакцину вводили внутрикожно в дозе 0,1 мл.

Из данных таблицы видно, что способ концентрирования вирусного антигена не влиял на иммуногенность вакцины. С увеличением степени концентрирования антигена возрастала иммуногенность вакцины, После концентрирования антигена в 30 раз вакцина в дозе 0,1 мл защищала 90 животных от заболевания и гибели при экспери- ментальном заражении. Все контрольные животные погибли, Дальнейшее увеличение степени концентрирования вирусного антигена или не дало повышения иммун ргенности вакцины (концентрирование в 40 раз), или снижало ее иммуногенность и вместе с тем затрудняло технологию изготовления препарата.

В табл. 5 приведены данные по сравнению эффективности применения различных адъювантов для усиления иммуногенности различных адъювантов для усиления иммуногенности инактированной вакцины. В качестве адъювантов использовали гидрат окиси алюминия (ГОА) и масляный адъювант (минеральное масло ПЗС-3-84 / и ланолин — 16 ). Указанные адьюванты добавляли к инактивированаму концентрированному в

30 раз антигену ВБА соответственно 15, (ГОА) и 60 (масляный адьювант), В последнем случае смесь гомагенизировали (8000 об/мин, 30 сек) до получения стойкой эмульсии (вода в масле). Иммуногенность вакцин без адъюванта, с ГОА и масляным адьювантом сравнивали на морских свинках, привитых внутрикожна в дозе 0,1 мл. и

Из данных табл. 5 видно, что добавление адъюванта значительно повышает иммуногенность инактивированной вакцины, Наиболее напряженный иммунитет создается при использовании эмульгированнаго препарата, в состав которого входит минеральное масло.

В табл. 6 представлены данные об изменении иммуногенных свойств инактивированной концентрированной эмульгированнай вакцины в процессе ее хранения при 2-6"С в течение 18 месяцев.

Иммуногенность препарата проверяли на морских свинках сразу после изготовления и через 6, 12, 18 месяцев хранения. Морских свинок вакцинировлли внутрикожно в дозе

0,1 мл.

Данные табл.6 свидетельствуют о высокой стабильности иммуногенных свойств инактивированной концентрированной эмульгированной вакцины в процессе хранения при 2-6 С, Специфическая активность препарата практически не изменилась в течение 18 мес хранения (срок наблюдения).

В табл.7 приведены результаты сравнительного испытайия иммуногенности трех вакцин на морских свинках: 1) вакцина, приготовленная на Ставропольской биофабрике по методу Армянского НИИ животноводства и ветеринарии; вакцина, "5 приготовленная фирмой Рон-Мерье (вакцина "Geskypur") и 3) инактивированная концентрированная эмульгированная вакцина, изготовленная по предлагаемому нами способу(вакцина "БАК"). Каждой вакциной прививали морских свинок двумя способами подкожно в дозе 1 мл и внутрикожно в дозе

0,1 мл. Контрольное заражение проводили через 21 день одновременно с невакцинирава ннь! ми животными.

Результаты этого исследования (табл.7) показали, что вакцина "БАК" обладает более выраженной иммуногенностью по сравнению с двумя другими при обоих способах вакцинации.

30 Разница в иммуногенности препаратов особенно отчетлива проявилась при внутрикажном способе введения вакцины в небольшой дозе (0,1 мл). Так, например, вакцина БАК защищала 90 животных, тогда как вакцина фирмы Рон-Мерье и АрмНИИЖиВ соответственно 50Я, и 10 g, привитых животных. Аналогичные данные получены при комиссионноу сравнительном испытании трех укаэанных вакцин на норках и ïåñ40 цах в совхозе "Родники" Московской области.

По предлагаемому способу была изготовлена на Армавирской биофабрике опытно-промышленная серия вакцины "БАК" в

45 количестве 340 л, Иммуногенность вакцины проверяли на овцах и морских свинках.

Овец прививали внутримышечно в дозе 1,0 мл. морских свинок падкожно в дозе 1,0 мл.

Контрольное заражение проводили виру50 лентным штаммом ВБА через 21 день, Все вакцинированные морские свинки (24 головы) и овцы (3 головы) оказались иммунными, а все контрольные морские свинки (10 голов) и овцы (2 головы) заболели и погибли от

55 болезни Ауески через 6-8 дней после эараженил. Указанная серия вакцины "БАК" полностью соответствовала требованиям ТУ (10,09.114-91 г., утверждены ГУВ MCX СССР

27,05.91 г.) и выпущена для использования в ветеринарной практике.

1822345

Таблица1

Накопление ВБА в различных культурах клеток и его иммуногенные свойства

П р и м е ч а н и е: Числитель-количество иммунных, знаменатель — количество зараженных животных.

Таблица.2

Накопление "в культуре и иммуногенность двух штампов ВБА

П р и м е ч а н и e: Числитель — количество иммунных, знаменатель — количество зараженных животных.

Инактивированная концентрированная эмульгированная вакцина против болезни

Ауески (вакцина "БАК"), приготовленная. по предлагаемому способу, имеет следующий состав;

1. Антиген

Инактивированный, концентрированный в 10-30 раз 35-407ь

2. Масляный адъювант

Минеральное масло 82-847ь 60-65 ф

Ланолин 18-16ф>

Формула изобретения

1. Способ изготовления инактивированной концентрированной эмульгированной вакцины против болезни Ауески, включающйй размножение вируса болезни Ауески в культуре клеток, его инактивацию, концентрирование культуральной жидкости, ее смешивание с адъювантом, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что вирус размножают в суспензионной культуре постоянной линии клеток с концентрацией 2-3 млн клеток в 1 мл и множественностью заражения 1-10

ТЦД5о/клетка, до титра 8-9 и до разрушения не менее 707, клеток, инактивацию прово5 дят 0,3 -ным формалином при 37 С в тече ние 72 ч, концентрирование в 10-30 раз проводят ультрафильтрацией, используя фильтрующие элементы, задерживающие молекулы массой > 15000 Д, или полиэти10 ленгликолем с мол.м. 6000 Д в конечной концентрации 9-107ь в присутствии 2,3;(,ного NaCl, из адъювантов используют масляный адъюван.т, а см-ешивание с вирусом осуществляют в соотношении 1:1,5-2.0.

2. Способ по и 1. отличающийся тем, что перед концентрированием ультра- ° фильтрацией клеточный детрит отделяют от жидкости сепарированием, гомогенизиру20 ют на коллоидной мельнице и объединяют с ультрафильтратом, 10

1822345

Таблица 3

Иммуногенность инактивированной вакцины приготовленной из осветленного и неосветленного культурального В БА

П р и м е ч а н и е: Числитель — количество иммунных, знаменатель — количество зараженных животных.

Таблица 4

П р и м е ч а н и е; Числитель — количество иммунных, знаменатель — количество зараженных животных.

Таблицаб

Влияние адъюванта на иммуногенность вакцины

Влияние способа и степени концентрирования антигена BSA на иммуногенность инактивированной вакцины

1822345

Продолжение табл. 5

Адъювант

О/5

Конт оль

П р и м е ч а н и е: Числитель — количество иммунных, знаменатель — количество зараженных животных.

Таблицаб

Изменения иммуногенности эмульгированной вакцины в процессе хранения

П р и м е ч а н и е; Числитель — количество иммунных, знаменатель — количество зараженных животных.

:Табл и ца7

Результаты сравнительной оценки иммуногенности различных вакцин на морских свинках

П р и м е ч а н и е: Числитель — количество иммунных, знаменатель — количество зараженных животных.

Редактор

Заказ 2115 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Характеристика вирусного сы ья

Иммуногенность для морских свинок

Составитель И,Тареева

Техред М.Моргентал" Корректор С.Патруева