Тетрапептид, обладающий способностью оптимизировать обучение и воспроизведение информации в стрессовых условиях
Использование: в производстве медпрепаратов нейротропного действия. Продукт: соединение формулы Tyr-D-Arg(NO2), обладающий способностью оптимизировать обучение и воспроизведение информации в стрессовых условиях, терапевтический индекс более 20. Условия реакции: синтез ведут последовательным наращиванием пептидной цепи с использованием активированных эфиров защищенных аминокислот. 1 ил. 4 табл.
Предлагается новое биологически активное соединение аналог анкефалина общей формулы 1 Tyr-D-Arg(NO2)Gly-Phe-OEt, обладающее нейротропной активностью, способностью оптимизировать функции головного мозга в стрессовых условиях обучения и воспроизведения информации, который может найти применение в медицине. Цель изобретения получение биологически активных новых соединений в ряду аналогов анкефалина, обладающих нейротропной активностью, способностью оптимизировать обучение и воспроизведение информации в стрессовых условиях. Наиболее близкими структурными аналогами заявляемому соединению являются мет- и лей-энкефалин, а по применению известный психостимулятор сиднокарб. Сопоставление в модельных опытах биологической активности заявляемого аналога энкефалина и препаратов сравнения свидетельствует о преимуществе заявляемого соединения (см. табл.1 и 2). При использовании синднокарба возможны побочные реакции: нарушение сна, увеличение числа ошибок, обострение продуктивной психологии, повышение артериального давления; ограничен его прием при выраженном атеросклерозе, гипертонии и др. Для синтеза аналога энкефалина формулы 1 используют аминокислоты и их производные фирмы "Реанал" (Венгрия). Все аминокислоты, кроме D-аргинина, имеют L-конфигурацию. Температуру плавления веществ определяют в капилляре (без коррекции). Индивидуальность соединений контролируют ТСХ на пластинках "Silufol"UV54 (ЧСР), а также применяют стеклянные пластинки с закрепленным слоем силикагеля Silicagel 60 F-254 фирмы Merk (ФРГ). Используют следующие системы растворителей: хлороформ этанол уксусная кислота (AcOH), 85:10:5 (A); н-бутанол пиридин АсОН Н2О, 15:10:3:6 (Б); хлороформ метанол АсОН-Н2O 30: 20: 4: 6 (Г); 60:18:2:3 (Д); н-бутанол АсОН Н2О 4:1:1 (Е). Хроматограммы проявляют нингидриновым и хлорбензидиновым реагентами. Удельное оптическое вращение пептидов измеряют на автоматическом цифровом поляриметре Perkin Elmer 141 M (США), длина кюветы 1 дм. Кислотный гидролиз проводят при 120оС в течение 24 ч. Аминокислотный состав определяют на анализаторе Jeol-3. Для всех соединений данные элементного анализа удовлетворительно совпадают с вычисленным содержанием. Схема синтеза аналога энкефалина формулы 1 представлена на чертеже. П р и м е р. Этиловый эфир N-трет-бутилоксикарбонилглицилфенилаланина (2). 6,9 г (30 моль) этилового эфира гидрохлорида фенилаланина растворяют в 30 мл диметилформамида (ДМФА) охлаждают до -5оС и при перемешивании добавляют 4,2 мл (30 ммоль) триэтиламина (Et3N) в 9 мл ДМФА и 12,7 г (30 ммоль) пентахлорфенилового эфира N-трет-бутилоксикарбонилглицина, растворенного в 20 мл DMF. Смесь выдерживают 1 ч при -5оС, 24 ч при 0оС и еще 24 ч при комнатной температуре. Затем реакционную массу выливают в 500 мл воды со льдом, выделившееся вещество отфильтровывают. Осадок растворяют в этилацетате и органическую фазу промывают последовательно 5%-ным раствором бикарбоната натрия, водой, 5% -ным раствором калия сернокислого кислого, вновь водой, насыщенным раствором хлористого натрия, сушат над безводным сульфатом натрия, растворитель отгоняют. Выход 9,8 г (93%) дипептида (2) в виде масла с Rf 0,84 (А), 0,90 (Г, Merk); [
]D22-3,04o (c 1,05, ДМФА). Этиловый эфир N-трет-бутилоксикаpбонил-N-нитро-D-аргинилглицилфенил- аланина (4). 9,6 г дипептида (2) растворяют в 120 мл 50%-ного раствора трифторуксусной кислоты в хлористом метилене и выдерживают в течение 30 мин. Раствор упаривают, остаток растворяют с эфиром, сушат в вакууме над гидроксидом калия. Получают 8,1 г (81%) трифторацетата дипептида (3) с Rf 0,24 (А), 0,74 (Г, Merk). К охлажденному до 0оС раствору 8 г (22 ммоль) трифторацетата дипептида (3) а 25 мл ДМФА прибавляют 3,08 мл (22 моль) триэтиламина. Реакционную смесь перемешивают 15 мин при 0оС, прибавляют 7,0 г (22 ммоль) N-трет-бутилоксикарбонил-NG-нитро-D- аргинина в 20 мл ДМФА, 2,97 г (22 моль) 1-гидроксибензотриазола и затем по каплям раствор 4,53 г (22 ммоль) N,N'-дициклогексилкаpбодиимида в 20 мл ДМФА. Смесь перемешивают 1 ч при 0-5оС, затем при комнатной температуре до завершения реакции (хроматографический контроль). Выпавшую в осадок дициклогексилмочевину отфильтровывают, фильтрат разбавляют 200 мл этилацетата и водой (до разделения слоев). Этилацетатный слой отделяют и водную фазу экстрагируют повторно. Объединенный этилацетатный слой обрабатывают аналогично соединению (2). Вхыод 7,77 г (64%) трипептида (4) с Rf 0,45 (А), 0,90 (Б, Merk), 0,60 (Д); т. пл. 150-152оС; []D22+3,4o (c1, ДМФА). Этиловый эфир N, O-ди-трет-бутилокси-карбонилтирозил-NG-нитро-D- аргинилглицилфенилаланина (6). 5 г (9,07 ммоль) трипептида (4) обрабатывают раствором трифторуксусной кислоты в хлористом метилене аналогично соединению (3). Выход 4,9 г (95%) трифторацетата трипептида (5) Rf 0,20 (А). Из 4,52 г (8 ммоль) трифторацетата трипептида (5), 1,36 мл (8 ммоль) N, N-диизопропилэтиламина и 4,29 г (8 ммоль) пентафторфенилового эфира N,O-ди-трет-бутилоксикарбонилтирозина в растворе ДМФА аналогично соединению (2) получают тетрапептид (6). Остаток, полученный после отгона растворителя, растирают с эфиром, сушат в эксикаторе и очищают обращеннофазовой хроматографией на колонне Lorbax C8, элюируя смесью: ацетонитрил-вода-уксусная кислота, 40: 59,9: 0,1. Соответствующие фракции собирают и лиофилизируют. Выход 3,88 г (53%) защищенного тетрапептида (6) с Rf 0,60 (А), 0,85 (Б, Merk); 0,9 (Г, Merk), 0,75 (Д); т.пл. 99-101оС; []D22+2,3o (c 0,6, ДМФА). Этиловый эфир трифторацетата тирозил-NG-нитро-D-аргинилглицилфенилала- нина (1). 0,25 г (0,307 ммоль этилового эфира защищенного тетрапептида (6) растворяют в 5 мл 50%-ного раствора трифторуксусной кислоты в хлористом метилене и выдерживают в течение 30 мин. Растворитель отгоняют, остаток растирают с эфиром. Образовавшийся осадок переосаждают из спирта эфиром, отфильтровывают, вновь промывают эфиром и высушивают в вакууме над гидроокисью калия. Получают 0,21 г (87) продукта (1) с т.пл. 115-117оС; []D22+50,5o (c 0,4; 0,2 н. АсОН); Rf 0,60 (Б, Мerk), 0,66 (Г, Merk), (E, Merk). Аминокислотный анализ: глицин 1,00, фенилаланин 1,03, тирозин 0,86, аргинин 0,92. Индивидуальность полученного соединения подтверждена спектром ЯМР, а также методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Пептид элюировался одним пиком с коэффициентом емкости К'[]D22=7,2 (колонка Lorbax C8, 4,6x150 мм, подвижная фаза: ацетонитрил 0,2 М раствор ацетата аммония, 20:80, pH 5,0, скорость 1,5 мл/мин, детекция при 220 нм). Биологическая активность заявляемого аналога энкефалина изучена в процессе выработки у нелинейных белых крыс-самцов массой 170-180 г оборонительного условного рефлекса активного избавления и избегания (УРАИ) в У-образном лабиринте. Использована модифицированная методика. Безусловным раздражителем служило электроболевое подкрепление, условным свет и направление правильного выбора освещенного отсека камеры. Использована схема непрочной однократной выработки УРАИ с проверкой воспроизведения навыка через 48 ч. Подсчитывалось число ошибок, число сочетаний условного и безусловного раздражителей, необходимое для достижения критерия обученности, и время его достижения. За критерий обученности принимался последовательный 6- и более кратный правильный выбор животным освещенного отсека лабиринта за 1-2 с. Изучался эмоциональный статус, проводилось общее наблюдение за поведением животных. Однократно подкожно до начала выработки УРАИ отдельным группам крыс вводился один из исследуемых препаратов: заявляемый аналог энкефалина (0,10 и 0,25 мг/кг) или препараты сравнения психостимулятор синдрокарб (3 мг/кг), мет- или лей-энкефалин (по 0,25 мг/кг каждого). В контроле вводился физиологический раствор (равный объем на единицу массы животных). Нейротропная активность препаратов, в частности влияние на процесс обучения и воспроизведения информации при выработке оборонительного условного рефлекса, представлена в табл.1 и 2. Заявляемый аналог энкефалина Tyr-D-Arg(NO2)Gly-Phe-OEt обладает выраженной нейротропной активностью в оптимальном при подкожном введении диапазоне эффективных доз 0,10-0,25 мг/кг, ускоряет обучение животных и воспроизведение ими навыка, в чем превосходит препараты сравнения сиднокарб,мет- и лей-энкефалин. При первичном обучении (см. табл. 1) аналог энкефалина существенно, в 1,5-2 раза, увеличивает число обучившихся животных и устойчивость реакции правильного выбора освещенного отсека камеры, снижает число ошибок, время обучения, число повторений ситуации до достижения критерия обученности, время одной побежки и число задержек условного рефлекса. Повторное (через 48 ч) обучение этих же животных также показало значимое преимущество нейротропной активности аналога энкефалина: по число обученных животных, времени обучения и времени каждой побежки, числу повторений сигналов до достижения животными критерия обученности, в устойчивости реакции правильного выбора освещенного отсека камеры, в снижении числа задержек условного рефлекса. В наибольшей степени различия с контролем и препаратами сравнения проявлялись при первичном обучении животных в стрессовых условиях болевой электростимуляции. По тесту УРАИ положительное действие аналога энкефалина регистрировалось до 3-4 ч после инъекции. Эффективность препаратов сравнения в сопоставлении с контролем была незначительной. При внутривенном введении белым мышам заявляемого аналога энкефалина из расчета дозы 5,0 мг/кг летального эффекта не отмечено в течение последующих 5 суток наблюдения. Это свидетельствует от его низкой токсичности (терапевтический индекс превышает 20). Таким образом, заявляемый аналог энкефалина является новым малотоксичным соединением, нейротропное оптимизирующее влияние которого на обучение и воспроизведение информации в стрессовых условиях превышает активность природных лей- и мет-энкефалина и психостимулятора синднокарба. Дополнительно приведены экспериментальные данные сопоставления биоэффектов заявленного аналога энкефалинов и пирацетама в табл.3 и 4. Вся информация, приведенная в табл.1 и 2, сохраняет действительность. Препараты вводились подкожно группам животных в диапазоне доз: заявленный аналог энкефалинов в дозах 0,01-0,1-0,25 мг/кг; пирацетам в дозах 10; 50 и 250 мг/кг; в контрольных группах в соответствии с массой тела животных вводился равный объем физиологического раствора. Описание метода выработки у крыс оборонительного условного рефлекса активного избавления и избегания (УРАИ) приведено в материалах заявки на изобретение. Результаты опытов свидетельствуют о преимуществе заявленного аналога энкефалинов (см. табл.3 и 4): по величине положительного эффекта по всем регистрируемым показателям первичного и повторного обучения животных при стрессе (выработка динамичного оборонительного рефлекса у крыс в У-камере); по терапевтической широте и низким величинам эффективных доз (0,01; 0,1 и 0,24 мг/кг), достоверность стимулирующих процесс обучения и память животных при стрессе; по более высокому терапевтическому индексу, так, для эффективной дозы 0,01 мг/мг он превышает 5000 (при стрессе).
Формула изобретения
Тетрапептид формулы Tyr D Arg(NO2)Gly Phe Oet, обладающий способностью оптимизировать обучение и воспроизведение информации в стрессовых условиях.РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Номер и год публикации бюллетеня: 14-2002
Извещение опубликовано: 20.05.2002
