Способ выделения антигена 8 возбудителя мелиоидоза
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
K ПАТЕНТУ )
4Р
С)
Д
Ь) (л
Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 4942088/13 (22) 04.06.91 (46) 1512.93 Бюл. Na 45-46 (71) Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт (72) Храпова Н.П.; Смирнова В.И.; Пивень Н.Н.; Прохватилова E.Â. (73) Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт (54) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА 8 ВОЗ(в) RU (и) 2004251 Cl (51) 5 А61К39 02
БУДИТЕЛЯ 1ЛЕЛИОИДОЗА (57) Использование: медицина, иммунологические исследования. Сущность изобретения: исходную антигенную смесь пропускают через колонку с монокпональными антитепами против антигена 8 воз— будит ел я мелиоидоза конъюгированными с
CNBr-сефарозой 4В в течение 120 — 150 мин при концентрации антител 2 — 9 мг/мл геля с последующей десорбцией антигена глицин Na0H буфером, рН 10,5 — 11,0. 1 ил„1 табл.
2004251 обрабатывают бромцианом, разведенным
Изобретение относится к медицине и касается получения высокоочищенного антигена возбудителя мелиоидоза, антигена 8 (АГ8).
Известны различные способы выделения антигенных комплексов из микробных клеток возбудителя мелиоидоза. Так, выделены и охарактеризованы полисахаридсодерацетонитрилом, из расчета 0,2 г бромциана на 1 мл геля. Затем свежеактивированный гель быстро переносят на воронку со стеклянным фильтром и промывают с отсасыванием ледяной дистиллированной водой и охлажденным 0,1 М бикарбонатным буфером, рН 8,2, в течение 60 с. После отмывания гель быстро переносят в колбу с раствором
i4КА против АГ8, разведенных на 0,1 M бикарбонатном буфере с 0,5 M NaCL рН 8,2, до концентрации 9-10 мг антител на 1 мл геля.
Смесь инкубируют в течение 120 мин и бо10
20 химически гомогенен и серологически активен, l1o химическому составу он представляет собой гликопротеин с содержанием белка
10% и полисахаридов 90%. Количество выделяемого АГ8 зависит от объема сорбента и величины колонки, нагрузки исходной антигенной смеси на сорбент и от удельного содержания АГ8 в исходной смеси.
Пример 1, Изучение динамики связывания MKA против АГ8 с активированной сефарозой.
Скорость связывания MKA с носителем определяли в течение 4 ч по изменению исходной. концентрации белка в суперна40 танте реагентной смеси. Через 15-20 мин происходило 50%, через 60 мин — 75-80%, через 120 мин — 90% связывание. В последующие 2 ч присоединения МКА к сорбенту было незначительным. Поэтому оптимальное время коныюгирования МКА с активированным гелем — 120-150 мин, а количество связанных с носителем MKA — 2-9 мг на 1 мл геля.
Пример 2, Подбор условий десорбции
АГ8. После нанесения исходной антигенной
50 (MKA) мм Р pm-1. Штамм-продуцент МКА депонирован во Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером В СКК ((!) 276Д.
По заявке на штамм гибридомы мм Р pm-I М смеси на колонку и вымывания всех несвязавшихся компонентов приступают к разруLUeHNIo связи АГ-АТ и элюированию с колонки ЛГ8. Для десорбции различных биополимеров, как правило, применяют глицерин-HCL, pH 2,2-2,8, B опыте 0,1 M глицеин-HCL буфер, рН 2,8, также оказался эффективным десорбирующим агентом. Однако было отмечено, что под его воздействи4864957/13 получено положительное решение оТ 29,06.90 r.
Иммуносорбент готовят на основе коммерческой CNBt-активированной сефарозы
4В. Активацию сефароэы 4В можно проводить в лабораторных условиях. В этом случае непосредственно перед опытом гель ем снижается АГ-связывающая активность жащие комплексы иэ целых клеток и клеточныхстенок Pseudomonas pseudomaliel.
Методы выделения поверхностных полисахаридов из микробных клеток основаны на экстракции их органическими растворителями.
Наиболее близким является способ получения мелиоидозного полисахаридного антигенного комплекса, обогащенного АГ8, пригодного для иммуннохимических и иммунологических исследований. Способ представляет собой формамидную экстракцию полисахаридного антигенного комплекса из обезэараженных ацетоном клеток Р.
pseudomailel. При обработке микробных клеток формамидом возможна. определенная степень деградации выделяемого антигена.
Оптимизация температурного режима обработки клеток формамидом уменьшает эти негативные воздействия и повышает степень антигенного комплекса, обогащенного АГ8, Однако получение гомогенного препарата данным способом черезвычайно сложно, Нередко требуется дополнительная очистка АГ8.
В тоже время проведение иммунохимических и иммунологических исследований требует наличия стандартов антигенов, соответствующих антигенной схеме возбудителя мелиоидоэа, максимально сохранивших структурные и биологические свойства соответствующих биополимеров микробной клетки.
Целью изобретения является повышение чистоты целевого продукта — антигена 8 возбудителя малиоидоза.
Цель достигается тем, что смесь водорагтворимых антигенов Р. pseudomallel подвергают аффинной хроматографии на колонке с моноклоналbíûM иммуносорбентом. Иммуносорбент готовят путем конъюгирования активированной CNBr-сефарозы
4В с моноклональными антителами. лее при рН среды 8,5. Готовым моноклональным иммуносорбентом заполняют хроматографическую колонку, через которую пропускают исследуемую смесь антигенов возбудителя мелиоидоза, диализованную против забуференного 0,15 M раствора ИаС „ рН 7,2. Несвязавшиеся с МКА компоненты смеси вымывают из колонки этим же раствором, а затем производят десорбцию специфического антигена (АГ8) 0,1М раствором NaOH
-глицинового буфера, рН 10,5-11,0.
Очищенный таким способом АГ8 иммуно2004251
Сводная таблица данных по очистке АГ8 методом аффинной хроматографии. иммуносорбента и он становится непригодным для многократного повторного использования. Применение глиц.ин-NaOH буфера, рН 10,5-11,0 во всех случаях обеспечивало эффективное выделение АГ8 и не влияло на АГ-связывающую активность иммобилизованных на носителе МКА. Многократное применение (три и более раз) иммуносорбента было продемонстировано во всех опытах по получению высокоочищенного антигена.
Таким образом оптимальным десорбирующим агентом признан глицерин-NaQH буфер, рН 10,5-11,0.
Пример 3. Изучение диапазона возможных источников выделения АГ8.
Для выделения АГ8 использовали различные антигенные смеси: водно-солевые экстракты, формамидные экстракты и экстрацеллюлярные антигены. В таблице представлены данные по очистке АГ8.
Установлено, что выход АГ8 зависит от нагрузки на колонку и от насыщенности этим
АГ исходного материала. Так, при относительно небольшом содержании суммарного количества сахаров удельная концентрация АГ8 в
ЭЦА максимальна. Менее насыщенным АГ 8 являются водно-солевой и формамидный экстракты. Поэтому при использовании последних в качестве источника АГ8 следует увеличивать нагрузку на колонку исходной антигенной смеси, а при препаративном получении АГ8 наиболее пригодным исходным материалом является ЭЦА.
Гомогенность и идентичность образцов
АГ8, полученных в опытах, представленных . в таблице, была подтверждена с помощью реакции иммунодиффузии в геле и иммуноэлектрофореза с гипериммунной поликлональной сывороткой.
Пример 4. Сравнительная оценка иммунохимической гомогенности антигенных препаратов, приготовленных различными способами.
Антигенный состав различных препаратов, приготовленных с помощью водно-солевой, формамидной экстракции, ионообменной и аффинной хроматографии, изучали с помощью иммуноэлектрофореза с гипериммунной поликлональной козлиной сывороткой против антигенов возбудителя мелиоидоза (см. чертеж). На чертеже пока5 вана Иммунофореграмма антигенов P.
pseudomallel ill, выделенных различными методами.
1,5- В СЭ, приготовленный в результате клеток ультразвуком. Концентрация — 3
10 мг/мл.
2 — формамидный экстракт. Концентрация — 12,5 мгlмл.
3 — АГ, приготовленный после ионообменной хроматографии на ДЕАЕ-сефадексе
15 А-25. Концентрация — 12,5 мг/мл. 4 — АГ8 очищенный методом аффинной хроматографии с помощью иммобилизованных на сефарозе МКА против данного АГ.
Концентрация — 5 мгlмл.
20 В продольные канавки внесена гипериммунная козлиная сыворотка против клеток Р,pseudomallei 100.
Иммунохимическая гомогенность АГ8 зарегистрирована при выделении его с по25 мощью моноклонального иммуносорбента методом аффинной хроматографии.
Таким образом, предлагаемый способ очистки АГ8 возбудителя мелиоидоза с помощью моноклонального иммуносорбента
30 позволяет выделять из различных антигенных смесей иммунохимически гомогенный
АГ8, пригодный для последующего использования в иммунохимических и иммунологических исследованиях.
35 (56) Захарова И.Я., Косенко Л.В. Изучение микробных полисахаридов. Киев, Наукова думка, 1982, с. 25-26.
Журнал микробиология, эпидемиология
40 и микробиология, 1981, N . 4, с. 78-82.
Пивень Н.Н, Смирнова В.И, Выделение, очистка и химический состав поверхностного полисахаридного антигенного комплекса возбудителя мелиоидоза. В кн:
45 Особо опасные инфекционные заболевания: диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителей, Сб. науч. работ, Волгоград, 1989, вып. 4, с. 111-117.
2004251
Штамм-и родуцент
Исходный антиген
Нагрузка на колонку (мг сахаров) Концентрация сахаров
В исходном материале (мг/мл) Выхо саха ов мг
6,34
0,34
P. pseudomallel
56830
11,5
0,73
0,8
P. pseudomallel
111
7,5
2,5
10,7
Р. pseudomallel
100
2,97
0,57
0,67
23,3
0,57
P. pseudomallei
100
0.50
2,97
18,0
12,0
0,145
P. pseudomal tel
111
10,0
3,1
68,0
Р. раен бота Ие!
100
1,72
4,55 экстракт
Экстрацеллю1,0
0,42
5,5
18,0
P. pseudomallel
57576 лярный антиген
Водно-солевой экстракт
Формамидный экстракт
Э кстрацелл юлярный антиген
Э кстрацеллюлярный антиген
Формамидный экстракт
Водно-солевой
Формула изобретения
СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ АНТИГЕНА 8, ВОЗБУДИТЕЛЯ МЕЛИОИДОЗА из антигенной смеси, отличающийся тем, что, с целью повышения чистоты антигена, антигенную смесь пропускают через колонку с
Продолжение таблицы сорбентом СМ В г-сефа роза 4 В, ко ныл ги рованная с моноклональными антителами против антигена 8 мелиоидоза, в течение
120 - 150 мин при концентрации антител 2
9 мгlмл геля с последующей десорбцией антигена глицин-NaOH буфером, рН 10,511,0, 2004251
Составитель О. Шанова
Редактор В. Трубченко Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор Н. Король
Тираж Подписное
НПО "Поиск" Роспатента
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
Заказ 3363
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101
