Способ регистрации изменения поверхностного заряда эритроцитов

 

Способ регистрации изменения поверхностного заряда эритроцитов. Использование: в области медицины, в частности в лабораторной диагностике. Сущность изобретения: исследуемые клетки фиксируют в растворе глутарового альдегида, отмывают и разводят в забуференном физиологическом растворе, затем помещают в кювету и добавляют хлористый лантан в концентрации 0,30-0,35 ммоль, изменение поверхностного заряда рассчитывают по степени агрегации клеток с помощью агрегатограммы. Способ прост в исполнении. 3 ил.

Изобретение относится к медицине и биологии и может быть использовано для регистрации изменения поверхностного заряда эритроцитов при нарушении реологических показателей крови.

Известен способ определения поверхностного заряда эритроцитов путем измерения их электрофоретической подвижности.

К недостаткам известного способа следует отнести сравнительную трудоемкость определения изменения поверхностного заряда эритроцитов, труднодоступность специальных приборов.

Известен также способ регистрации изменения поверхностного заряда эритроцитов, заключающийся в измерении степени агрегации, предварительно зафиксированных глутаровым альдегидом эритроцитов, стимулируемой положительно заряженным веществом - полилизином.

Однако недостатком известного способа регистрации изменения поверхностного заряда эритроцитов является длительность определения агрегации эритроцитов (в среднем 12 мин).

Цель изобретения - сокращение времени регистрации изменений поверхностного заряда эритроцитов.

Поставленная цель достигается тем, что эритроциты фиксируют глутаровым альдегидом, затем отмывают от фиксатора, добавляют хлористый лантан (0,30-0,35 мМ) и определяют их агрегацию, изменения поверхностного заряда рассчитывают по агрегатограмме.

Способ осуществляют следующим образом. Свежую кровь хранят не более 1-2 ч при 4^оС в присутствии гепарина (100 ед/мл). Центрифугируют 10 мин при 1000g. Плазму и клетки белой крови удаляют, а эритроциты дважды промывают 10-кратным объемом физиологического раствора. Отмытые эритроциты фиксируют в 0,6% -ном растворе глутарового альдегида (0,05-0,1%) в течение 20 мин. Фиксация эритроцитов глутаровым альдегидом необходима для того, чтобы агрегирующее вещество, в данном случае хлористый лантан, взаимодействовал только с внешней, отрицательно заряженной поверхностью эритроцитов. То есть не проникал в клетку и не изменял ее форму. Концентрация глутарового альдегида выбрана с целью проведения "мягкой" фиксации клеток, не влияя при этом на заряд эритроцитов. После чего эритроциты дважды отмывали физиологическим раствором от фиксатора.

Принцип метода определения изменения поверхностного заряда по изменению агрегации эритроцитов, индуцированной хлористым лантаном, основан на том, что агрегация эритроцитов происходит по механизму образования мостиков между отрицательными зарядами взаимодействующих клеток и положительно заряженным хлористым лантаном. Чем меньше отрицательный заряд клеток, тем меньше агрегация эритроцитов, и наоборот.

Отмытые от глутарового альдегида эритроциты разводят в соотношении 1: 200 в забуференном физиологическом растворе (10 ммоль трис-HCl, 146 ммоль NaCl, рН-7,4). После этого эритроциты помещают в кювету для изучения агрегации и добавляют хлористый лантан 0,33 ммоль (0,30-0,35 ммоль). Концентрация хлористого лантана подбиралась опытным путем. При концентрациях меньше 0,30 ммоль не происходит агрегации эритроцитов, а начиная с 0,30 ммоль агрегация быстро нарастает и в области 0,33 ммоль выходит на плато. При дальнейшем повышении концентрации хлористого лантана степень агрегации клеток не изменяется, так что использование концентраций выше 0,33 ммоль не целесообразно. Степень агрегации определяется количественно, так же как и других клеток крови, например тромбоцитов, фотометрическим методом на агрегометрах. После добавления агрегирующего агента происходит падение оптической плотности суспензии клеток, так как идет просветление за счет образования агрегатов эритроцитов. Падение оптической плотности фиксируется на ленте самописца в виде кривой, которая называется агрегатограммой (денситограммой). Чем сильнее происходит взаимодействие эритроцитов, тем больше амплитуда агрегатограммы (М). Максимальная амплитуда агрегатограммы измеряется в миллиметрах.

Агрегацию эритроцитов изучали на установке, смонтированной на основе фотоколориметра КФК-2, сопряженного с самописцем КСП-4. В фотоколориметр вставлялась пробирка с суспензией эритроцитов, в нее помещалась мешалка, состоящая из электрического мотора с валом. За 100% принимается амплитуда агрегатограммы контрольных интактных клеток. Затем измеряется амплитуда агрегатограммы опытных клеток. Определяется процент изменения поверхностного заряда по отношению к заряду контрольных интактных клеток.

П р и м е р 1. Добавление хлористого лантана к интактным эритроцитам вызывает их агрегацию М=49 мм (фиг. 1).

На приводимом графике по оси ординат (Y) откладывается амплитуда агретограммы, по оси абсцисс (Х) время.

П р и м е р 2. Добавление хлористого лантана к эритроцитам, предварительно обработанным трипсином М=33 мм, т.е. снижение поверхностного заряда на - 33% (фиг. 2).

П р и м е р 3. Добавление хлористого лантана к эритроцитам, предварительно обработанным нейраминидазой М= 25 мм, т.е. снижение поверхностного заряда на - 49% (фиг. 3).

Точность метода измерения изменения поверхностного заряда предлагаемым методом подтверждена в параллельных опытах, в которых измерение заряда определялось по электрофоретической подвижности эритроцитов.

Таким образом, предложенный способ является чувствительным и быстрым тестом на изменения поверхностного заряда эритроцитов. Более чем в 12 раз быстрее способа, взятого за прототип (менее 1 мин вместо 12 мин в прототипе).

Способ может быть использован для регистрации изменений поверхностного заряда клеток как в экспериментальных опытах, так и при различных гематологических заболеваниях человека и животных.

Формула изобретения

СПОСОБ РЕГИСТРАЦИИ ИЗМЕНЕНИЯ ПОВЕРХНОСТНОГО ЗАРЯДА ЭРИТРОЦИТОВ, включающий фиксацию исследуемых клеток, их отмывание и определение изменения поверхностного заряда по степени агрегации клеток, индуцированной агрегирующим веществом, отличающийся тем, что, с целью сокращения времени исследования, в качестве агрегирующего вещества используют хлористый лантан в концентрации 0,30 - 0,35 мм, а изменение поверхностного заряда рассчитывают по агрегатограмме.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3