Штамм бактерий bifidobacterium globosum, используемый для приготовления пробиотического препарата для ветеринарии

 

Использование: ветеринария, пробиотический препарат. Сущность изобретения: штамм Bifidobacterium dlobo-Sum БФ-4 обладает высокой антагонистической активностью, что позволяет повысить эффективность изготовленного из него пробиотического препарата. Для получения пробиотического препарата культуру штамма выращивают на любой приемлемой для бифидобактерий питательной среды в течение 48 ч до накопления клеток 10⁹cm³ Использование ветеринарного пробиотического препарата на основе штамма B.dlobo Sum БФ-4 по сравнению с медицинскими пробиотиками позволяет увеличить на 6 - 8% сохранность поголовья поросят при проведении лечебно-профилактических мероприятий при дисбактериозах алиментарного и бактерийного происхождения. 6 табл.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к штаммам, используемым для изготовления пробиотических препаратов.

Известны штаммы бифидобактерий, используемые для изготовления таких пробиотических препаратов, как бификол, кисломолочный бифидумбактерин, бифилин, бифивит, предназначенные в основном для медицинской практики (авт. св. СССР N 958493, 958494, 1013473).

Известен также штамм B. longum B 379М, используемый для изготовления пробиотического препарата, предназначенный также для медицинской практики и применяемый в ветеринарии ("Сборник научных трудов МНИИЭМ". - М.: 1986).

Пробиотические препараты на основе микроорганизмов рода Bifidobacterium являются видоспецифичными для того объекта, от кого они выделены, и, следовательно, от этого зависит эффективность терапевтического их проявления.

Медицинские препараты до настоящего времени не получили своего законного статуса, как не имеющие утвержденного наставления по применению.

Целью изобретения является штамм Bifidobacterium globosum, обладающий высокой антагонистической активностью, используемый для приготовления эффективного ветеринарного пробиотического препарата.

Штамм Bifidobacterium globosum получен направленной селекции выделенной культуры от здоровых поросят.

Штамм депонирован в коллекции микроорганизмов Всесоюзного государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов, идентифицирован как вид Bifidobacterium globosum и зарегистрирован под номером БФ-4.

Штамм Bifidobacterium globosum БФ-4 характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки.

Штамм имеет характерные для бифидобактерий признаки. При микроскопии мазков культуры штамма, выращенной на жидких и полужидких питательных средах для культивирования бифидобактерий, а также на обезжиренном молоке, наблюдают микроорганизмы, представляющие собой грамположительные короткие коккоподобные изогнутые или сферические клетки, расположенные или собранные в короткие цепочки, иногда с булавовидными утолщениями на конце.

Культурально-морфологические свойства.

Штамм хорошо растет на питательных средах, используемых для культивирования бифидобактерий, например на печеночной среде Блаурокка, гидролизатмолочной среде, среде Семенихиной, в виде крошковатой массы, гвоздиков с наличием прозрачной зоны в верхней части столбика среды. Штамм характеризуется достаточно высокой энергией роста, лаг-фаза не превышает 1 ч, фаза логарифмического роста заканчивается через 48 ч. Накопление бифидобактерий в 1 см³ гидролизатмолочной и кукурузно-лактозной среды, обезжиренного молока достигает через 48 ч культивирования 10¹⁰-10¹² микробных клеток.

На поверхности плотных питательных сред в анаэробных условиях штамм растет в виде мелких гладких выпуклых колоний от белого до кремового цвета.

Штамм аэротолерантен. Углекислый газ не влияет на анаэробный рост, штамм растет при подаче 10% углекислого газа и 90% воздуха. В аэробных условиях на поверхности плотных питательных сред не растет.

Физиологические признаки.

Желатин не разжижает. Индол и сероводород не образует. Каталазоотрицательный.

На обезжиренном молоке образует ровный слабый сгусток без отделения сыворотки. Активность кислотообразования 110 ± 5^oТ. При культивировании на молоке и молочной сыворотке не требует добавления ростовых веществ. Соотношение уксусной и молочной кислот примерно 3:2 (уксусная кислота 60-75%, молочная кислота 25-35% от общей кислотности).

Ферментативные свойства.

Штамм ферментирует с образованием кислоты без газа лактозу, галактозу, сахарозу, мальтозу, мелебиозу, D-рибозу, крахмал. Не ферментирует маннит, мелецитозу, трегалозу, α-арабинозу, ксилозу.

Патогенные свойства.

Штамм не вызывает гибели белых мышей при внутрибрюшинном введении живой или убитой культуры в дозе 5 ˙ 10⁹ микробных клеток.

П р и м е р 1. Изучают антагонистическую активность штамма B. globosum ВФ-4 и штамма сравнения B. longum B 379М методом развивающихся смешанных популяций и методом штриховых посевов на плотной питательной среде в отношении тест-микробов энтеропатогенных эшерихий, выделенных от поросят.

Культуры штаммов выращивают на кукурузно-лактозной среде в течение 20 ч.

Отбирают пробирки с выраженным ростом культур и по оптическому стандарту мутности доводят концентрацию до значения 10 ед.

Одновременно на скошенном мясопептонном агаре выращивают суточные культуры тест-штаммов эшерихий, выделенных из кишечника павших поросят и идентифицированных по антигенной структуре, ферментативным и вирулентным свойствам. Выросшие культуры смывают физиологическим раствором и доводят концентрацию бактерий по оптическому стандарту мутности до значения 10 ед.

Подготовленные взвеси тест-культур и бифидобактерий вносят по 1,0 см³ в пробирки с 9,0 см³ кукурузно-лактозной среды. Параллельно для контроля по 1,0 см³ взвеси тест-культур вносят в пробирки с 9,0 см³ кукурузно-лактозной среды. Посевы выдерживают в термостате при 38 ± 1^oC в течение 48 ч.

По окончании культивирования из развивающихся смешанных популяций и монокультур тест-штаммов делают ряд последовательных десятикратных разведений. Из разведений 10^-8, 10^-7, 10^-6 контрольных посевов тест-штаммов и из разведений 10^-4, 10^-3, 10^-2 cмешанных популяций делают высевы на агар Эндо. Посевы выдерживают в термостате при (38 ± 1)^oC в течение 20-24 ч.

Подсчитывают количество колоний, выросших из смешанных популяций и из монопосевов тест-культур.

Количество колоний (КОЕ), выросших в посевах монокультур, принимают за 100%. Вычисляют процент выживших клеток тест-штаммов в смешанных посевах по сравнению с контролем.

Положительным считается результат менее 1%.

Результаты представлены в табл.1.

Вывод Штамм B. globosum БФ-4 в смешанных популяциях угнетает рост тест-штаммов в большей степени, чем штамм B. longum B 379 М, что видно по высеваемости культур тест-штаммов из разведений 10^-2 и 10^-3, тогда как для штамма B. longum B 379 М характерна высеваемость тест-штаммов из разведений 10^-3 и 10^-4.

П р и м е р 2. Изучают антагонистическую активность сравниваемых штаммов по зонам задержки роста тест-культур штаммов колибактерий.

Для этого подготовленные по примеру 1 культуры бифидобактерий наносят штриховым посевом на плотную питательную среду Блаурокка по диаметру чашки Петри. Посевы инкубируют в термостате при 38 ± 1^oC в течение 48 ч.

Подготавливают суточные культуры тест-штаммов эшерихий по описанию первой части примера 1 и наносят их перпендикулярными штрихами по обеим сторонам выросших культур бифидобактерий. Посевы термостатируют при 38 ± 1^oC в течение 72 ч.

Учитывают зоны задержки роста тест-культур в миллиметрах. Антагонистическая активность бифидобактерий расценивается как удовлетворительная, если зона задержки роста тест-культур не менее 10 мм.

Результаты исследования отражены в табл.2.

Вывод.

Штамм B. globosum БФ-4 показал высокую антагонистическую активность при проверке методом штриховых посевов, превыша- ющую таковую у штамма B. longum B 379 М.

П р и м е р 3. Изучают сроки персистирования предлагаемого и известного штаммов бифидобактерий в кишечнике животных.

Длительность персистирования бактерий в организме обусловлена способностью штамма прикрепляться к стенке кишечника и размножаться в пристеночном слое или кишечном содержимом.

Формируют три группы беспородных белых мышей массой 14-16 г по 50 голов в каждой группе.

На кукурузно-лактозной среде выращивают двухсуточные культуры штамма B. globosum БФ-4 и штамма B. longum B 379М. Отбирают посевы с выраженным ростом культур и по оптическому стандарту мутности доводят концентрацию микробных клеток в образцах до значения 10 ед. стандарта мутности.

Первой группе мышей вводят однократно перорально по 0,5 см³ культуры штамма globosum БФ-4, второй группе - культуру штамма B. longum B 379 М в том же объеме. Третью группу мышей используют в качестве контрольной, которой вводят в том же объеме физиологический раствор.

По 10 мышей каждой из трех групп убивают через 6 ч, 3, 5 и 7 с после введения культур бифидобактерий. Вскрывают кишечники мышей, отбирают участки тонкого и толстого отделов кишечника и делают соскобы слизистой, захватывая часть содержимого кишечника.

Пробы переносят в среду Блаурокка, прокипяченную и охлажденную до 42^oC. Посевы выдерживают в термостате при 38 ± 1^oC в течение 6 ч. Затем из посевов делают ряд последовательных десятикратных разведений до значения 10^-6. Из каждого разведения берут одну каплю взвеси и наносят ее на поверхность плотной питательной среды Хеннеля или Блаурокка. Посевы тщательно растирают по поверхности среды, после чего чашки с посевами помещают в термостат при 38 ± 1^oC на 48 ч.

По окончании культивирования отмечают пробы с наличием колоний, типичных для бифидобактерий. Результаты подтверждают микроскопией мазка, окрашенного по Граму.

Положительным считается результат при наличии в посевах хотя бы одной колонии бифидобактерий в любом из взятых разведений. За 100% берется значение при высеваемости бифидобактерий от всех 10 мышей в каждом определении.

Опыт проводят в трех повторностях. Результат приведен в табл.3.

Вывод.

Штамм бифидобактерий B. globosum БФ-4 обладает большей приживляемостью в кишечнике белых мышей, чем штамм B. longum B 379 М, что видно по срокам его выделения из кишечника и кишечного содержимого.

П р и м е р 4. Изучают экологобиологические особенности испытуемых штаммов на примере сроков их персистирования в кишечнике поросят.

Формируют три группы новорожденных здоровых поросят по 35 голов в каждой группе. Культуры штаммов бифидобактерий, выращенные и подготовленные по примеру 1, вводят перорально двукратно с интервалом в 1 ч с помощью зонда поросятам первой группы в дозе 50,0 см³ за одно введение штамма B. globosum БФ-4, поросятам второй группы - в том же количестве культуру штамма B. longum B 379М. Поросят третьей группы используют в качестве контроля.

Через 1, 3, 5 с после введения бифидобактерий по 10 поросят из каждой группы убивают, отбирают участки тонкого и толстого отделов кишечника. В стерильных условиях отрезки кишечника вскрывают, очищают поверхность от избытка корма и делают соскобы слизистой, захватывая часть содержимого кишечника. Пробы тщательно перемешивают и переносят каждую в пробирки со средой Блаурокка. Посевы выдерживают в термостате при 38 ± 1^oC в течение 6 ч. По окончании культивирования из каждой пробы делают ряд последовательных десятикратных разведений до значения 10^-6.

По одной капле каждого разведения наносят на поверхность плотной питательной среды Хеннеля или Блаурокка. Посев тщательно растирают по поверхности среды и помещают в термостат при 38 ± 1^oC на 48 ч.

По окончании культивирования отмечают пробы с наличием колоний, типичных для бифидобактерий. Результат подтверждают микроскопией мазка, окрашенного по Граму. Положительным считается результат при наличии в посевах хотя бы одной колонии в любом из взятых разведений. За 100% берется значение высеваемости бифидобактерий от 10 поросят в каждом определении. Данные представлены в табл.4.

Вывод.

Из приведенной табл. 4 следует, что штамм B. globosum БФ-4 обладает большей видовой специфичностью для поросят, чем штамм B. longum B 379 М, приживляемость которого в кишечнике поросят через 5 с после введения не превышала контрольного значения.

П р и м е р 5. Испытывают профилактическую эффективность кисломолочных препаратов бифидобактерий, изготовленных из культуры штамма B. globosum БФ-4 и сухой закваски для приготовления кисломолочного бифидумбактерина на основе штаммов B. longum B 379 или B. bifidum 791 На обезжиренном стерильном молоке готовят два препарата кисломолочного бифидумбактерина. Первый - из культуры штамма B. globosum БФ-4, второй - из сухой закваски для приготовления кисломолочного детского бифидумбактерина, выпускаемой МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского.

Полученные препараты проверяют по внешнему виду, отсутствию бактерий группы кишечной палочки и концентрации живых бактерий в 1 см³ готового продукта.

Накопление живых бифидобактерий в 1 см³ пробиотического препарата из штамма B. globosum БФ-4 cоставило 10¹⁰ микробных клеток, в кисломолочном бифидумбактерине на основе штаммов B. lougum B 379 М 10⁹ микробных клеток в 1 см³ готового продукта.

Доводят стерильным физиологическим раствором препарат из штамма B. globosum БФ-4 до концентрации микробных клеток 10⁹ см³.

В качестве биологической модели для испытания препаратов используют поросят в хозяйстве, неблагополучном по колибактрериозу.

Формируют три группы новорожденных поросят по 100 голов в каждой группе. Первой группе поросят ежедневно в течение 21 дн индивидуально однократно выпаивают по 50,0 см³ пробиотического препарата на основе штамма B. globosum БФ-4. Второй группе поросят аналогично выпаивают медицинской препарат кисломолочного бифидумбактерина. Третья группа поросят находится на подсосе и используется в качестве контрольной.

Учет профилактической эффективности сравниваемых препаратов проводят на 21-й день опытов. Учитывают количество заболевших диспепсией поросят и процент падежа поросят от диспепсии. Результаты представлены в табл.5.

Вывод.

Из табл. 5 следует, что пробиотический препарат на основе штамма B. globosum БФ-4 обладает лучшими профилактическими свойствами, чем медицинский бифидумбактерин.

П р и м е р 6. Испытывают лечебную эффективность пробиотического препарата на основе штамма B. globosum БФ-4 и известного медицинского кисломолочного бифидумбактерина на поросятах-отъемышах с клиническими признаками острого дисбактериоза.

Формируют три группы поросят-отъемышей по 50 голов в каждой группе с клиническими признаками острого дисбактериоза (обезвоживание, профузный понос, истощение), от которых выделяют патогенные культуры сальмонелл.

Первой группе поросят задают перорально пробиотический препарат бифидобактерий на основе штамма B. globosum БФ-4, подготовленный по примеру 5, однократно перед началом кормления по 50,0 см³ за прием. Второй группе поросят аналогично задают пробиотический препарат кисломолочного медицинского бифидумбактерина, изготовленного по примеру 5. Третьей группе поросят назначают симптоматическую терапию и антибактериальные препараты.

Срок проведения опытов 10 д. Учитывают длительность проявления клинических признаков, количество павших и процент сохранности поросят за период опыта. Данные представлены в табл.6.

Вывод.

Из табл.6 видно, что пробиотический препарат на основе штамма B. globosum БФ-4 обладает лучшими терапевтическими свойствами по сравнению с медицинским пробиотиком и используемыми в хозяйстве антибактериальными средствами.

Пробиотический препарат, изготовленный из штамма Bifidobacterium globosum БФ-4 может найти широкое применение в ветеринарной практике при дисбактериозах бактерийной этиологии у поросят. Препарат готов к использованию.

Формула изобретения

ШТАММ БАКТЕРИЙ BIFIDOBACTERIUM GLOBOSUM, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ПРОБИОТИЧЕСКОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ ВЕТЕРИНАРИИ.

Штамм бактерий Bifidobacterium globosum ВГНКИ N БФ-4-ДЕП, используемый для приготовления пробиотического препарата для ветеринарии.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3