Штамм бактерий еsснеriснiа coli для получения рибавирина

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству противовирусных соединений, и касается нового штамма бактерий, используемого для получения рибавирина. Целью изобретения является новый, экспериментально полученный, штамм бактерии ESCHERICHIA COLI ВКПМ В-4834 с повышенной активностью клеток в реакции синтеза рибавирина. Рибавиринсинтезирующую активность измеряют путем прямого определения количества рибавирина, образующегося при инкубации сырой биомассы клеток с изанозином и ТК.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИ4ЕТЕЛЬСТВУ (21) 4724352/13 (22) 24,07.89 (46) 07.07.91. Бюл. ¹ 25 (71) Институт микробиологии АН БССР (72) Н,В.Дудчик, B,Н.Барай, А.И.Зинченко, С.Б,Бокуть, Е.И.Квасюк и И.А.Михайлопуло (53) 576.858(088.8) (56) Shlrae Н.. Jokozekl К., Uchlgyama М., Kubota K„Enzymatic production of г!Ьач!г!и

from purine nucleosides by Brevibacterium

acetyllcum АТСС 954/ — Agric. Biol. Chem.—

1988, ч. 52, ¹ 7, р. 1777-1783, (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA

C0LI ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ РИБАВИРИНА

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству противовирусных соединений, Целью изобретения является новый экспериментально полученный штамм бактерии Eschertchia coll БМТ-ЗД/1А с повышенной активностью клеток в реакции синтеза рибавирина, в связи с чем его используют для получения этого противовирусного нуклеозида, .Штамм Е.coll БМТ-ЗД/1А получен из музейного тиминзависимого штамма Е.coll и 3110 путем отбора наиболее активных вариантов при последовательном выращивании на плотной агаризованной среде

АдамСа с тимином (1 мкг/мл), затем с тиминарабинозидом (5 мкг/мл) в качестве источ-, ника тимина и наконец на среде, содержащей тимин (1 мкгlмл) и гуанозин (1 мгlмл) в качестве источника углерода.

„„. Ж „„1661209 (я)5 С 12 и 1/20, С 12 P 1/04 (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к производству противовирусных соединений, и касается нового штамма бактерий, используемого для получения рибавирина, Целью изобретения является новый,экспериментально полученный, штамм бактерии

Escherichla coll ВКПМ В вЂ” 4834 с повышенной активностью клеток в реакции синтеза рибавирина. Рибавиринсинтеэирующую активность измеряют путем прямого определения количества рибавирина, образующегося при инкубации сырой биомассы клеток с изанозином и ТК.

Штамм Е.coll БМТ-ЗД/1А депонирован . в коллекции промышленных микроорганизмов под коллекционным номером ВКПМ В—

4834 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические признаки.

Под микроскопом клетки имеют вид прямых палочек с закругленными концами (1,1-1,5)x(2-6) мкм. Встречаются отдельно или парами. Спор и капсул не образуют.

Клетки обладают подвижностью, По типу движения — перитрихи. Грамотрицательные.

В бульоне Хоттингера к 24 ч (37 С) рост выражен в виде легкого помутнения. На дне пробирок образуется комковатый осадок. который полностью взмучивается при встряхивании (S-форма), На МПА и агаризованной среде Адамса (37 С, 3 сут) колонии гладкие. слабо выпуклые, легко сливающиеся. Консистенция вяз1661209 кая. Цвет колоний сероватый. Поверхность блестящая, рельеф однородный. Края колоний слегка волнистые.

На агаризованной дифференциальной среде Эндо штамм растет в виде полупрозрачных колоний без изменения цвета среды.

Диапазон температуры роста 7 — 40 С.

Оптимальная температура 36 — 37 С.

Диапазон рН роста 5,5-8,5. Оптимум роста наблюдается при рН среды 7-7,5.

Физиолого-биохимические признаки.

Факультативный анаэроб. В процессе роста сбраживает до кислоты с незначительным выделением газа глюкозу, арабинозу, трегалозу, мальтозу, маннит, глицерин. Не усваивает сахарозу, лактозу, оафи нозу, сорбит, дул ьцит.

В качестве единственного источника углерода может использовать ацетат, но не цитрат и инозит, Желатину не разжижает, Крахмал не гидролизует.

Молоко не свертывает.

Гидролизует РН К.

Гемолитическими свойствами не обла,,ве-. He токсичен и не патогенен для теплокровных животных, Усваивает аммонийный и нитратный азот, Наиболее активный рост биомассы обеспечивают органические источники азота (пептон, дрожжевой и кукурузный экстракты, ферментолизат БВ К).

Продуцирует индол, каталазу.

Не образует уреазу и оксидазу.

Содержание Г+Ц в составе ДНК

50,3*0,5 мол.% (определено оптическим методом).

Штамм нетоксичен и непатогенен для теплокровных животных, Культура сохраняет жизнеспособность не менее года при хранении в холодильнике (4 С) на полноценной агаризованной среде (МПА, среза Хоттингера) под слоем вазелинового масла, а также в лиофильно- высушенном состоянии.

Штамм Е.coll БМТ-ЗД/1А способен синтезировать рибавирин с эффективностью

1,05 ммоль/ч/г клеток (в расчете на сухую массу).

Рибавиринсинтезирующую активность измеряют путем прямого определения количества рибавирина, образующегося при инкубации сырой биомассы клеток с гуанозином и ТК. С этой целью реакционную смесь (1 мл), содержащую 10 MM К-фосфатный буфер (рН 7), 15 кг клеток, гуанозин и ТК в концентрациях 0,3 М, инкубируют при 60

С в течение 8 ч. После инкубации реакционную смесь центрифугируют (8000g, 10 мин) на/ч/г.

35 Пример 2. Клетки Е.coll БМТ-ЗД/1А. выросшие в двух 250 мл колбах, согласно примеру 1, используют в качестве посевного материала и засевают ими лабораторный ферментер АК-3 емкостью 3 л, содержащий

40 2 л питательной среды следующего состава, г/л: 6 йагНР04; 3 КН2Р04; 0.5 NaCI; 1 NH

0,125 MgS04 х 7HzO; 40 ферментализат БВ К.

Начальное значение рН 7,5. Ферментацию ведут 12 ч при 37 С и аэрацией 0,8 л/мин

45 на 1 л среды.

По окончании культивирования клетки собирают центрифугированием (800Og, 10 мин), получая 8 r клеток (в расчете на сухую массу) с рибавиринсинтезиру50 ющей активностью 1,05 ммоль/ч/г сухой массы.

10 мл смеси, содержащей 0,3 М ТК, 0,3

М гуанозина, 10 мМ К-фосфатный буфер (рН

7), инкубируют с перемешиванием 30 ч при

55 60 С. После осаждения клеток центрифугированием (8000g. 10 мин) их дважды промывают 10 мл воды. Супернатанты объединяют и наносят на колонку(2,5х4 см) с ионообменной смолой Оовех 50w х 8 в Н -форме. Колонку промывают водой. Фракции, 10

30 и надосадочную жидкость хроматографиру-, ют на тонкослойной пластинке "Silufol

UVgg4" (КачаИег, ЧССР) в системе растворителей изопропано-хлороформ — 25% водный аммиак (10:5:2). Целевой продукт обнаружен в УФ-свете, идентифицируя сравнением с положением образца-свидетеля, и элюируют водой, После внесения в элюат фосфатного буфера (рН 7) его оптическую плотность замеряют на спектрофотометре.

Концентрацию рибавирина рассчитывают, используя коэффициент молярной экстинции при длине волны 207 нм, равный 11600.

В таблице дана сравнительная оценка эффективности наиболее активных иэ 80 проверенных штаммов микроорганизмов.

Пример 1, Культуру штамма Е,coll

6МТ-ЗД/1А вносят петлей с косяка в колбы емкостью 250 мл, содержащие 50 мл МАБ с

0,5%-ным дрожжевым экстрактом и 0,5%

NaCl, культивируют на биологической качалке (180 об/мин, в течение 16 ч при 37 С.

Приготовленным посевным материалом в количестве 5% засевают лабораторный ферментер АК-3 емкостью 3 л, содержащий 2 л питательной среды того же состава. Ферментацию ведут 12 ч при 37 С с аэрацией

0,8 л/мин на 1 л среды.

По окончании культивирования клетки собирают центрифугированием (80O0g, 10 мин), получая 3,5 г клеток (в расчете на сухую массу) с рибавиринсинтезирующей активностью 1 ммоль рибавири1661209

Примечание. Относительная эффективность других штаммов не превышает 10 .

Составитель В. Агафонова

Редактор М; Стрельникова Техред M.Ìîðãåíòàë . Корректор Э. Лончакова

Заказ 2097 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат. "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 содержащие рибавирин (200 мл), объединяют и наносят на колонку (1,15х4 см) с ионообменной смолой Dowex 1x8 в ОН=форме.

Промывая колонку водой, получают раствор рибавирина (340 мл), который упаривают до объема 6 мл, прибавляют 30 мл этанола и упаривают досуха. Остаток. растворяют в 5 мл этанола при нагревании с обратным холодильником на водяной бане. После кристаллизации на холоде рибавирин собирают на стеклянном фильтре и сушат до постоянной массы при 60 С в течение 18 ч в суховоздушном шкафу. Получено 0,491 r хроматографически чистого целевого продукта, что соответствует выходу 67 от теоретическии возможного.

При хроматографировании на тонкослойных пластинках "Silufol-Ожгу" в системах растворителей изопропанол-хлороформ — 25 аммиак(10:5:2) и н-бутанол—

25 аммиак (7:2) подвижность целевого продукта совпадает с Rr контрольного препарата рибавирина.

Т.пл. целевого продукта 163 †1 С.

Элементный анализ для СвН 205И4, M =

5 =244.

Найдено, ф,: С 39.85; Н 4,99; N 22,70.

Вычислено, ; С 39,34; Н 4,95; N 22,94.

1н-ЯМР(ДМСΠ— бв)7м.g. от ТМС: 8,87 с (1Н, H— - 5); 7,82 с (1Н. МН ); 7,62 с (1Н, 10 CONH2);5,82д(1Н, Н вЂ” 1, J ),Я = 3,6 Гц); 5.55 уш.с(1Н, ОН вЂ” 2 ), 5,17 уш.с (1Н, ОН вЂ” 3 ); 4,90 уш.с(1Н, ОН вЂ” 5 ); 4,37дд(1Н, Н вЂ” 2 . f3, 3 =

4,8 Гц); 4,17 дд (1Н, Н вЂ” 3, Я, . 4 = 4,8 Гц);

3,97 м (1Н, Н вЂ” 4 ); 3,63 дд (1Н. Н вЂ” 5, J4, 4

=3,6 Гц. А, 5 =; 3,52дд(1Н, Н вЂ” 5", Js, 4=4,8 Гц).

Формула изобретения

20 Штамм бактерий Escherichia coll

ВКПМ-В-4834 для получения рибавирина.