Способ получения гепарина

 

Способ получения гепарина относится к производству медицинских препаратов. Сущность способа: экстрагируют измельченные легкие крупного рогатого скота (КРС) водно-солевым раствором в щелочной среде. Отделенный жмых подвергают экстракции 2,3 2,5 М раствором поваренной соли при рН 9,0 9,2, 40 80°С и соотношении фаз 1 (1,4 1,7). Полученный экстракт используют для приготовления экстрагента измельченных легких КРС. Способ позволяет увеличить выход гепарина на 20 25% и дополнительно выделить хондроитинсульфат.

Изобретение относится к производству медицинских препаратов, в частности к получению биологически активного вещества-гепарина, а также сопутствующих гликозаминогликанов.

Гепарин представляет собой кислый мукополисахарид (гликозаминогликан) и является препаратом антикоагулянтного действия.

Начиная с 60-х годов, гепарин получают из различного вида животного сырья (печень, легкие, мукоза и др.) экстракцией солевыми растворами и выделением целевого продукта из экстракта осаждением подходящим осадителем или комплексоном.

Известные способы выделения гепарина из животного сырья не позволяют достаточно полно извлекать целевой продукт и значительная часть его вместе с сопутствующими гликозаминогликанами теряется с отходами производства.

Наиболее близким по технической сущности и приемам осуществления является способ, заключающийся в экстракции измельченных легких крупного рогатого скота водно-солевым раствором в слабощелочной среде при повышенной температуре. Гепарин, содержащийся в экстракте, концентрируют сорбцией на анионитах с последующим элюированием. Элюат подвергают химической очистке, после чего целевой продукт осаждают этанолом.

Недостатками этого способа являются: неполное извлечение гепарина из исходного сырья, что связано с тем, что процесс экстракции равновесный и выбранные оптимальные параметры процесса позволяют достигнуть выхода 20 тыс. ед. из 1 кг сырья; невозможность в данных условиях выделить из исходного сырья достаточное количество сопутствующих гликозаминогликанов (например, хондроитинсульфатов). Многочисленными исследованиями установлено, что изменение условий экстрагирования, например соотношение фаз, рН, ионной силы раствора, а также продолжительности и температурного режима экстракции не приводит к значительному увеличению выхода гепарина и ценных сопутствующих компонентов.

Цель изобретения увеличение выхода гепарина и дополнительное извлечение сопутствующих гликозаминогликанов (например, хондроитинсульфата).

Для этого жмых легких, полученный после экстракции гепарина, подвергают дополнительной экстракции 2,5 н раствором хлорида натрия при рН 9,0-9,2 соотношении (мас. ) жмых:экстракт 1:(1,4-1,7) при 40-%-80^оС в течение 40-90 мин, экстракт отделяют и используют для приготовления экстрагента.

Ниже приведены примеры реализации предлагаемого способа.

П р и м е р 1. В круглодонную колбу загружают 750 г жмыха легких крупного рогатого скота (КРС) 1125 мл 2,5 молярного раствора хлорида натрия (соотношение твердой и жидкой фаз 1:1,5) доводят рН до 9,2, смесь нагревают до 60^оС, перемешивают 60 мин и отделяют жмых на центрифуге. Полученный экстракт (1020 мл) загружают в круглодонную колбу, туда же загружают 1 кг измельченных легких КРС 38,6 г хлорида натрия, 980 мл дистиллированной воды, устанавливают рН 8,8, нагревают до 60^оС ± 2^оС, перемешивают 2 ч, нагревают до 100^оС, выдерживают 2 мин, охлаждают до 50^оС, и отделяют жмых на центрифуге. К полученному экстракту прибавляют 100 мл макропористого сильноосновного анионита АМ-п в Сl-форме, нагревают до 60^оС и перемешивают 6 ч. Затем анионит отделяют, промывают дистиллированной водой, переносят в колонку, промывают 1М-раствором хлорида натрия и десорбируют гепарин 2,5-молярным раствором хлорида натрия. Элюат осаждают 1,5 объемами этанола и перемешивают 1 ч. Осадок отделяют центрифугированием и высушивают на воздухе и в вакуумном сушильном шкафу при 50-60^оС. Получают 0,415 г Na-соли гепарина-сырца активностью 72 ЕД/мг.

П р и м е р 2. Получение гепарина-сырца проводят, как в примере 1, но устанавливают кислотность экстрагента жмыха, равной 9,0. В результате получают 0,410 г Na-соли, гепарина-сырца активностью 71 ед/мг.

П р и м е р 3. Получение гепарина-сырца проводят, как в примере 1, но устанавливают рН экстрагента жмыха, равный 9,1. Экстракцию проводят при соотношении твердой и жидкой фаз, равном 1:1,4, т.е. объем экстрагента составляет 1050 мл. Полученный экстракт в количестве 960 мл загружают в круглодонную колбу и прибавляют 1 кг измельченных легких КРС, 38,8 г NaCl, 1040 мл дистиллированной воды и далее поступают, как в примере 1. В результате получают 0,375 г Na-соли гепарина-сырца активностью 76 ед/мг.

П р и м е р 4. Проводят процесс, как в примере 3, однако соотношение фаз при экстракции жмыха составляет 1:1,7. В результате получают 0,383 г Na-соли гепарина-сырца активностью 81 ед/мг.

П р и м е р 5. Процесс проводят, как в примере 1, при рН экстрагента жмыха, равном 9,1, соотношении фаз, равном 1:1,5, и концентрации NaСl в экстрагенте, равной 2,3 Моль/л. В результате получают 0,407 г Na соли гепарина-сырца активностью 72 ед/мг.

П р и м е р 6. Процесс проводят, как в примере 5, однако концентрация NaCl в экстракте составляет 2,4 Моль/л. В результате получают 0,327 г/л Na-соли гепарина-сырца активностью 85 ед/мг.

П р и м е р 7. Процесс проводят, как в примере 1, при соотношении фаз 1: 1,5 молярности раствора NaCl, равной 2,4, рН 9,1, при 40^оС. В результате получают 0,393 г Na-соли гепарина-сырца активностью 70 ед/мг.

П р и м е р 8. Процесс проводят, как в примере 7, но при 80^оС. В результате получают 0,420 г Na-соли гепарина-сырца активностью 75 ед/мг.

П р и м е р 9. Процесс проводят, как в примере 8, при соотношении фаз 1: 1,5, молярности раствора NaCl 2,4, рН 9,1 60^оС, но продолжительность экстракции составляет 40 мин. В результате получают 0,320 г Na-соли гепарина-сырца активностью 86 ед/мг.

П р и м е р 10. Проводят, как в примере 9, но продолжительность экстракции составляет 90 мин. В результате получают 0,340 г Na-соли гепарина-сырца активностью 84 ед/мг.

П р и м е р 11. В реактор вместимостью 25 л загружают 7,5 кг жмыха легких КРС и прибавляют 11,25 л 2,4 М раствора NaCl. Устанавливают рН 9,1 добавлением 20%-го раствора NaOH, смесь нагревают до 60 ± 2^оС за 30-35 мин и выдерживают при этих условиях и постоянном перемешивании 60 мин. Жмых отделяют на нутч-фильтре, отжимая его до остаточной влажности 74% Полученный экстракт в количестве 10,35 л загружают в реактор вместимостью 25 л и прибавляют 0,386 кг NaCl, 10 кг измельченных легких КРС и 9,65 л дистиллированной воды. Затем добавлением 20% -го раствора NaOH устанавливают рН 8,8, нагревают до 100^оС, выдерживают при этой температуре 2-3 мин и охлаждают до 50^оС. Полученный экстракт отделяют на нутч-фильтре, отжимая твердую фазу до остаточной влажности 77% Жмых в количестве 7,6 кг направляют на повторную экстракцию по предлагаемому способу, а из экстракта (22,4 л) выделяют гепарин-сырец ионообменным способом в колоночном варианте. Выход гепарина-сырца составляет 3,78 г активностью 78 ед/мг.

В табл. 1 приведены основные характеристики технологического процесса, включающие крайние границы интервалов.

П р и м е р 12. Химическую очистку Na-соли гепарина-сырца, полученной по примеру 11, проводят следующим образом.

К 3,8 г гепарина-сырца активностью 78 ед/мг приливают 100 мл апирогенной дистиллированной воды, перемешивают до полного растворения, устанавливают рН 8,0-8,5 и нагревают до 70^оС, после чего приливают 1,3 мл 30%-ного раствора натрия марганцово-кислого. Продолжают нагревание при перемешивании до полного обесцвечивания раствора. После этого добавляют 1 г активированного угля и медленно перемешивают в течение 1 ч. Смесь фильтруют на воронке Бюхнера через фильтрующие пластины типа ЕКS-1, КО-5, КО-7. К отфильтрованному раствору добавляют последовательно 0,1 г бисульфита натрия, 0,7 г натрия хлористого и фильтруют через пластины SKS-IIp и мембранный фильтр типа "Раll" и "Millipor". После фильтрации к раствору добавляют 3 мл апирогенной дистиллированной воды, в которой растворено 4,07 г трилона Б. Раствор охлаждают и приливают к нему при перемешивании 60 мл охлажденного этанола-ректификатора. Выпавший осадок гепарина отделяют, высушивают и взвешивают. Получают 1,84 г порошка гепарина активностью 140 ед/мг. Выход по стадии химочистки составляет 85% выход гепарина 25200 ед/кг.

П р и м е р 13. Химочистку гепарина-сырца, наработанного по примерам 1-10 проводят, как в примере 12, объединяя гепарин-сырец, полученный от 10 одинаковых загрузок. Результаты химочистки приведены в табл. 2.

П р и м е ч а н и е 1. В графе "Активность гепарина-сырца" приведена активность усредненного сырца от 10 аналогичных загрузок.

П р и м е ч а н и е 2. В графе "Выход на стадии,", рассчитывался по формуле: 100% Из таблицы видно, что выход гепарина, полученного по предлагаемому способу, составляет 24-26 тыс. ЕД/кг, что на 25% больше, чем в действующей технологии. Внедрение в промышленность предлагаемого способа позволит на 25% увеличить производство гепарина без увеличения количества перерабатываемого сырья и без увеличения мощностей.

П р и м е р 14. К 11,2 л экстракта, полученного, как в примере 11 (собранного после колонки и освобожденного от гепарина), прибавляют 22,4 л охлажденного этилового спирта-ректификата и оставляют для созревания осадка на 2 ч при перемешивании. После этого осадок отделяют на стаканчиковой центрифуге. Надосадочную жидкость сливают, а осадок помещают в стакан, куда прибавляют 0,5 М раствор NaCl до общего объема 1,25 л. Добавлением 20%-го NaOH устанавливают рН 9-9,2 и перемешивают до получения до однородной суспензии, затем прибавляют 75 мл сильноосновного макропористого анионита в Cl-форме и оставляют при перемешивании и 50±2^оС на 18 ч. После этого анионит отделяют, промывают 50 мл 0,5 М раствором NaCl, помещают в колонку диаметром 2,2 см и промывают снизу вверх 125 мл 0,5 растворa NaCl со скоростью 40 мл/мин. После окончания промывания проводят десорбцию 2,5 М раствором NaCl со скоростью 10 мл/мин, причем собирают 125 мл элюата. К этому количеству элюата добавляют 250 мл этилового спирта-ректификата, охлажденного до 3-5^оС и полученную смесь медленно перемешивают при 8-10^оС в течение 2 ч. Осадок отделяют на воронке Бюхнера, промывают 50 мл этилового спирта-ректификата и высушивают в вакуум-шкафу при 50^оС до постоянного веса. Выход хондроитинсульфата (структуру устанавливают по данным ЯМР-спектроскопии) составляет 1,35 г.

П р и м е р 15. 11,2 л экстракта, полученного как в примере 11 (собранного после колонки и освобожденного от гепарина), разбавляют в два раза дистиллированной водой и устанавливают рН 9-9,2 20%-ным раствором NaOH, полученный раствор нагревают до 50±2^оС при этой температуре пропускают через колонку диаметром 3,6 см, содержащую 375 мл сильноосновного макропористого анионита в Cl-форме со скоростью 185 мл/мин. После окончания сорбции проводят десорбцию 2,5 М раствором NaCl со скоростью 30 мл/мин и собирают 580 мл элюата. К элюату добавляют 1200 мл этилового спирта-ректификата, охлажденного до 3-5^оС и полученную взвесь медленно перемешивают при 8-10^оС в течение 2 ч. Осадок отделяют на стаканчиковой центрифуге, переносят на воронку Бюхнера, промывают два раза по 30 мл этилового спирта-ректификата и высушивают в вакуум-сушильном шкафу при 50^оС до постоянного веса. Выход порошка составляет 1,83 г. По данным УФ-спектроскопии он содержит 25% хондроитинсульфата, остальное нуклеиновые кислоты.

П р и м е р 16. 11,2 л экстракта, полученного по действующей технологии, прошедшего через колонны, обрабатывают, как в примере 14. Выход хондроитинсульфата составляет 0,54 г.

П р и м е р 17. 11,2 г экстракта, полученного как в примере 16, обрабатывают, как в примере 15. Выход порошка составляет 1.68 г. По данным УФ-спекстроскопии он содержит 96% нуклеиновых кислот.

П р и м е р 18. В реактор вместимостью 25 л загружают 11,25 л отработанного экстракта (из которого ионообменным методом извлечен гепарин), прибавляют 0,658 кг и 7,5 кг жмыха легких, полученных после отделения экстракта по известному способу, включают мешалку, доводят рН до 9,1 20%-ным раствором NaOH, содержимое реактора нагревают до 60±2^оС за 30-35 мин и выдерживают при этой температуре 60 мин. Далее поступают, как в примере 11.

Выход гепарина-сырца составляет 4,78 г, его активность 68 ед/мг.

Отработанный вторичный экстракт делят на две части. Одну часть обрабатывают, как в примере 14. Выход хондроитинсульфата составляет 1,96 г.

Другую часть обрабатывают, как в примере 15. Выход порошка составляет 2,74 г, в котором содержится 19% хондроитинсульфата.

Из примеров 14-18 видно, что, осуществляя экстракцию по предлагаемому способу, удается из отработанных экстрактов извлечь дополнительные продукты, в том числе хондроитинсульфат ценный гликозаминогликан, используемый в медицинской и парфюмерной промышленности. Внедрение способа позволит получить дополнительно за счет комплексного использования сырья около 100 кг/год хондроитинсульфата.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЕПАРИНА из легких крупного рогатого скота путем измельчения сырья, экстрагирования 0,8 1,2 М водно-солевым раствором с pH 8,5-8,8 при 60-100^oС и массовом соотношении твердой и жидкой фаз 1:(2-3), отделения жмыха и дальнейшего выделения гепарина из супернатанта ионообменным методом на анионите, отличающийся тем, что жмых подвергают дополнительной экстракции 2,3-2,5 М водно-солевым раствором с pH 9,0-9,2 при 40-80^oС 40-90 мин и массовом соотношении твердой и жидкой фаз 1:(1,4-1,7), а полученный супернатант используют для приготовления эстрагента легких.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2