Способ определения содержания гемоглобина в крови, реактив- комплексообразователь и раствор-калибратор для его осуществления

 

Использование: медицина. Сущность изобретения: проводят обработку пробы крови реактивом-комплексообразователем, включающим додецелсульфат натрия, измеряют оптическую плотность раствора на двух различных длинах волн, значения которых находятся в области 550-595 нм, определяют значение содержания гемоглобина по результатам этим измерений. В процессе измерения используют реактив-комплексообразователь, дополнительно содержащий додецилсульфат натрия в количестве 0,03-0,15% водный раствор хлорида натрия, рН 7-7,5. Используют раствор-калибратор, содержащий известное количество гемоглобина, растворенного в реактиве-комплексообразователе, включающем додецилсульфат натрия. 3 с. и 2 з.п. ф-лы, 1 ил.

Изобретение относится к медицине и может быть использовано в гематологии при проведении исследований крови.

Известен способ определения содержания гемоглобина в крови, согласно которому содержащиеся в крови различные формы гемоглобина трансформируют к одному устойчивому продукту гемиглобинцианиду, а концентрацию гемоглобина определяют по результатам измерения оптической плотности этого продукта. В качестве трансформирующих агентов (комплексообразователей) при этом используют токсичные вещества цианистый калий или ацетонциангидрин, что является недостатком способа.

Наиболее близким к изобретению является способ определение содержания гемоглобина в крови, согласно которому обрабатывают пробу крови реактивом-комплексообразователем, включающим додецилсульфат натрия, определяют содержание гемоглобина по результатам измерений оптической плотности полученного раствора в области длины волны 540 нм.

Способ имеет следующие недостатки: результаты измерений содержат ошибку, вызванную присутствием в растворе рассеивающих свет частиц (продукты лизиса эритроцитов, липопротеиды и т.д.) и влиянием оптических свойств реактива-комплексообразователя, значение содержания гемоглобина определяют, используя фиксированное (9860) значение коэффициента экстинкции, связывающего значение оптической плотности с содержанием гемоглобина; однако действительное значение указанного коэффициента может существенно отличаться от указанного значения, так как условия измерений контролируемого раствора, как правило, отличаются от условий, в которых был определен коэффициент экстинкции (различные размеры используемых кювет, различные спектральные характеристики используемых фотометров, различия в составе и концентрациях дозируемых веществ, различные характеристики используемых мер вместимости); на практике указанный недостаток может быть устранен, если перед определением содержания гемоглобина проводят определение калибровочного коэффициента (на том же оборудовании и с теми же реактивами), используя для этого раствор-калибратор с известным содержанием гемоглобина, при этом в качестве раствора калибратора используют раствор гемиглобинцианида; однако при использовании реактива-комплексообразователя, включающего додецилсульфат натрия, получаемый продукт имеет спектр поглощения, существенно отличающийся от спектра поглощения гемиглобинцианида, что не позволяет использовать последний в качестве калибратора.

Экспериментально установлено, что спектр оптического поглощения продукта, получаемого при обработке крови указанным реактивом, стабилен только при значении водородного показателя рН реактива в пределах 7-7,5, в случае же выхода значения рН за указанные пределы спектр конечного продукта претерпевает сильные изменения, что сильно ухудшает точность определения содержания гемоглобина.

Цель изобретения повышение точности определения содержания гемоглобина в крови.

На чертеже представлены кривые, характеризующие оптическую плотность в функции длины волны для конечного продукта, получающегося в результате обработки крови реактивом-комплексообразователем, включающим додецилсульфат натрия (пунктирная кривая) и для конечного продукта (гемиглобинцианида), получаемого известным способом.

Сущность предложенного способа заключается в том, что проводят обработку пробы крови реактивом-комплексообразователем, включающим додецилсульфат натрия, измеряют оптическую плотность полученного раствора и определяют содержание гемоглобина по результатам измерений, при этом измерения оптической плотности проводят на двух различных длинах волн, значения которых находятся в области 550-595 нм.

Используемый реактив-комплексообразователь включает додецилсульфат натрия, при этом значение водородного показателя рН реактива находится в пределах 7-7,5.

Реактив-комплексообразователь может содержать додецилсульфат натрия и водный раствор хлорида натрия при содержании додецилсульфата натрия в пределах 0,3-0,15% Раствор-калибратор, имеющий известное содержание гемоглобина, согласно изобретению содержит раствор гемоглобина в реактиве-комплексообразователе, включающем додецилсульфат натрия.

Определение содержания гемоглобина по результатам измерений оптической плотности раствора на двух длинах волн из диапазона 550-595 нм позволяет уменьшить ошибку, вызванную влиянием рассеивающих частиц.

При значении показателя рН реактива в пределах 7-7,5 спектр получаемого продукта остается практически неизменным, что исключает ошибку, связанную с нестабильностью спектра поглощения.

Состав реактива-комплексообразователя, включающий додецилсульфат натрия и водный раствор хлорида натрия при содержании додецилсульфата натрия в пределах 0,03-0,15% имеет значение показателя рН в пределах 7-7,5, что и требуется для получения стабильного спектра конечного продукта.

Использование в качестве раствора-калибратора раствора гемоглобина в реактиве-комплексообразователе, включающем додецилсульфат натрия, позволяет проводить с высокой точностью определение калибровочного коэффициента непосредственно перед определением содержания гемоглобина за счет того, что спектр поглощения указанного раствора-калибратора совпадает со спектром конечного продукта, получаемого в результате обработки крови указанным комплексообразователем.

Способ основан на соотношениях, в которых использованы следующие обозначения: λ₁,λ₂- используемые длины волны; g₁, g₂ коэффициенты поглощения света гемоглобином на длинах волн соответственно λ₁,λ₂ С_g содержание гемоглобина в контролируемом растворе; d длина оптического пути (определяется толщиной используемой кюветы); h₁, h₂ коэффициенты рассеяния света на длинах волн λ₁,λ₂; I_λ1(2) исходная (падающая на кювету с контролируемым раствором) интенсивность света на длинах волн λ₁,λ₂; I'_λ1(2) интенсивность света после прохождения через слой контролируемого раствора.

С учетом поглощения и рассеяния света в контролируемом растворе можно записать: exp[-g₁·C_д·d-h₁·d]
(1)
exp[-g₂·C_д·d-h₂·d] Логарифмы отношений в левых частях соотношений (1) представляют собой не что иное, как значения оптических плотностей Е₁, Е₂. После логарифмирования получим:
E₁= lg -g₁·C_д·d-h₁·d
(2)
E₂= lg -g₂·C_д·d-h₂·d Вычитая из первого соотношения второе, получим:
E₁ E₂ Cg ˙d˙ (g₂ g₁) + d˙ (h₂ h₁) (3) Второй член в правой части этого соотношения не равен нулю, так как значения h₁, h₂ являются функциями λ, т. е. h₁(λ₁)≠h₂ (λ₂). Однако, если выбрать значения λ₁,λ₂ достаточно близкими друг к другу (практически целесообразно выбирать λ₁,λ₂ лежащими в пределах 550-595 нм), то можно придать величине d˙ (h₂ h₁) пренебрежимо малое значение. Если значением этой величины пренебречь, окончательно получим
C_д= (4)
Таким образом, значение C_g однозначно определяется значением разности оптических плотностей контролируемого раствора, измеренных на двух различных, но близких длинах волн (величины d, g₁ и g₂ постоянные при использовании одной и той же кюветы и одних и тех же длин волн). Измерение значений оптических плотностей может быть легко реализовано с использованием существующей аппаратуры для фотометрирования.

Необходимо отметить, что чувствительность описанного способа определяется, как следует из выражения (4), значением d ˙(g₂ g₁). Поскольку значения λ₁, λ₂ должны быть близкими для уменьшения влияния рассеяния, то для получения удовлетворительной чувствительности необходимо выбирать λ₁,λ₂ в области, где характеристика поглощения света конечным продуктом имеет наибольшую крутизну. Исследования спектра конечного продукта (см. чертеж) показали, что спектральная характеристика имеет крутой спад в области правее 540 нм. Поэтому выбор значений λ₁,λ₂ в пределах 550-595 нм (практически лучшие результаты достигаются при выборе длин волн соответственно 570 нм и 595 нм) позволяет, с одной стороны, получить удовлетворительную чувствительность, и с другой стороны, уменьшить ошибку из-за рассеяния.

Способ осуществляют следующим образом.

К пробе крови добавляют реактив-комплексообразователь, через 30 с измеряют значения оптических плотностей раствора Е₁, Е₂ на двух различных длинах волн (например, 570 и 595 нм), содержание гемоглобина в крови определяют из соотношения:
C_g (E₁ E₂) ˙N ˙K (5) где N коэффициент разведения крови (практически целесообразно выбирать значения N порядка 250, так как при этом возможные значения оптической плотности составляют 0,3-0,4 и могут быть измерены с высокой точностью на существующих фотометрах);
К калибровочный коэффициент.

Калибровочный коэффициент определяют, измеряя на указанных длинах волн в тех же условиях и на том же оборудовании оптические плотности Е_о1, Е_о2 раствора-калибратора
K
Для приготовления раствора-калибратора может быть использована консервированная кровь, из которой выделяют эритроциты (например, центрифугированием), отмывают из изотоническим раствором, к полученной эритроцитарной массе добавляют примерно равный объем изотонического раствора и получают модельный образец крови. Данный образец обрабатывают реактивом-комплексообразователем, включающим додецилсульфат натрия, и получают реактив-калибратор. Точное содержание гемоглобина в реактиве-калибраторе устанавливают путем измерения содержания гемоглобина в модельном образце крови референтным методом.

На практике в качестве раствора-калибратора удобно использовать стандартный раствор гемиглобинцианида. Это возможно, если описанным способом измерения оптической плотности проводит в области 570-595 нм. Как видно из чертежа, в целом спектр гемиглобинцианида отличен от спектра конечного продукта, получаемого описанным способом, однако в области длин волн 570-595 нм спектры практически совпадают, что и позволяет использовать гемиглобинцианид в качестве калибратора.

Практически используемый состав реактива-комплексообразователя следующий: додецилсульат натрия 1 г и водный (0,9%-ный раствор хлорида натрия до 1 л. Указанный состав реактива-комплексообразователя имеет значение водородного показателя рН 7,4.

Результаты экспериментальных исследований подтвеpждают высокую точность определения содержания гемоглобина в крови с использованием описанных способа, реактива-комлексообразователя и раствора-калибратора. Погрешность определения содержания гемоглобина в крови не превышает 1-2%

Формула изобретения

1. Способ определения содержания гемоглобина в крови, согласно которому осуществляют обработку пробы крови реактивом-комплексообразователем на основе додецилсульфата натрия, измеряют оптическую плотность полученного раствора и определяют содержание гемоглобина по результатам измерений, отличающийся тем, что проводят измерение оптической плотности на двух различных длинах волн λ₁ и λ₂ значения которых лежат в диапазоне 550 595 нм, а содержание C гемоглобина рсссчитывают из соотношения
C (E₁ E₂)·N·K,
где E₁, E₂ значение оптических плотностей раствора на длинах волн λ₁ и λ₂;
N коэффициент разведения крови;
K калибровочный коэффициент.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что калибровочный коэффициент определяют по результатам измерений на указанных длинах волн оптической плотности раствора калибратора из выражения

где E₀₁, E₀₂ значения оптических плотностей раствора на длинах волн соответственно λ₁ и λ₂
C₀ эквивалентное содержание гемоглобина в растворе-калибраторе.

3. Реактив-комплексообразователь для определения содержания гемоглобина в крови, включающий додецилсульфат натрия, отличающийся тем, что содержание додецилсульфата натрия находятся в пределах 0,03 0,15% а значение водородного показателя рН реактива находится в пределах 7,0 7,5.

4. Реактив-комплексообразователь по п.3, отличающийся тем, что содержит 0,1% -ный раствор додецилсульфата натрия и водный 0,9%-ный раствор хлорида натрия.

5. Раствор-калибратор для определения содержание гемоглобина в крови, имеющий заданное содержание гемоглобина, отличающийся тем, что он содержит раствор заданного количества гемоглобина в реактиве-комплексообразователе на основе додецилсульфата натрия.

РИСУНКИ

Рисунок 1