Диоксоди-бета-аланинато-молибден, проявляющий свойства гепатопротектора

 

Использование: в химико-фармацевтической промышленности, в частности в способе получения активного вещества - диоксо-ди-бета-аланинато-молибдена (АМ), предупреждающего нарушение белоксинтезирующей функции печени при гепатите. Сущность изобретения: способ получения АМ предусматривает реакцию оксида молибдена (6+) с дигидратом щавелевой кислоты с образованием оксалатного комплекса молибдена с последующей заменой лиганда в комплекте на бета-аланин. Полученное соединение имеет следующий состав: Mo O₂(C₃ H₆ No₂)₂ · H₂O и структуру [NH -(CH) C(O)-O-O-Mo-O-O-(O)-C-(CH) NH] · HO, выход 88%. Наиболее эффективная доза для стимуляции белоксинтезирующий органелл гепатоцита 0,40 г/кг массы животного, токсичность ЛД(50) - 1814 мг/кг массы животного. 5 ил., 3 табл.

Изобретение относится к химико-фармацевтической промышленности, а именно к новым биологически активным соединениям, конкретно, к диоксоди-бета-аланинато-молибдену формулы I NH₂-CH₂-CH₂-COMOOC-CH₂CH₂-NHH₂O (I) предупреждающему нарушение белоксинтезирующей функции печени.

Наиболее близким по химическому строению к предлагаемому соединению (I) является диоксодицестеиномолибден [1] (соединение II) формулы II SH-CH₂-COMOOC-CH₂-SH3H₂O (II) обладающий антианемической активностью.

Однако действие его на функцию печени не установлено.

Аналогом по действию является бисаква, моно(метилметионинат сульфония хлорид, глицинат) меди (соединение III) [2] формулы III CH₂-CH₂-S (III) оказывающий pегенеративное действие на ткани печени, пораженной токсическим гепатитом, влияющий на паренхиму печени, а также стимулирующий разрастание соединительной ткани.

Недостатком соединения (III) является высокая токсичность. Кроме того, хотя установлена морфологическая картина его действия, но оно не изучено на ультраструктурном уровне. Наряду с репаративными процессами паренхимы в печени увеличивается процесс разрастания соединительно-тканых элементов, а это нежелательное побочное действие.

Целью изобретения является синтез биологически активного соединения молибдена (VI), расширяющего спектр существующих гепатопротекторов, обладающих лечебным и профилактическим действием при гепатитах, оказывающего влияние на функциональное состояние ядра и усиливающего ассимиляторные процессы в гепатоцитах.

Указанная цель достигается синтезом соединения формулы I NH₂-CH₂-CH₂-COMOOC-CH₂-CH₂-NHH₂O (I) Заявляемое соединение получают по методике [3] следующим образом.

Смесь 7,2 г (0,05 моль) МоО₃ и 12,6 г (0,1 моль) дигидрата щавелевой кислоты в 90 мл воды нагревают на водяной бане до полного растворения МоО₃ (8 ч). Получаемый раствор оксалатного комплекса без отгонки воды нагревают до 120^оС и к нему добавляют 8,9 г (0,1 моль) бета-аланина. Массу нагревают в течение 8 ч при температуре кипения раствора (120^оС), затем охлаждают и через двое суток отделяют выпавшие кристаллы от маточного раствора. Целевой продукт промывают этиловым эфиром и ацетоном и дважды перекристаллизовывают из водного раствора. Получают 13,43 г (88,3% выход от теоретического) целевого продукта состава МоО₂ (С₃Н₆NO₂)₂ ˙Н₂О.

Найдено, С 22,19; Н 4,47; N 4,48; Мо 29,75; Н₂О 5,31.

Вычислено, С 22,36; Н 4,35; N 8,70; Мо 29,81; Н₂О 5,59.

Полученное соединение представляет собой прозрачные голубоватые, гигроскопичные кристаллы, хорошо растворимые в воде, практически не растворимые в эфире, ацетоне, хлороформе, гексане и несколько лучше растворимые в ДМСО и этаноле. Для идентификации соединения снимали ИК-спектры в виде таблеток СsI и КВr на приборе Specord М-80 и М-40, ЭСП на приборе Specord UV Vis, молярную электрическую проводимость, провели дериватографические измерения со скоростью нагрева 10^оС в минуту.

Анализ ИК-спектров бета-аланина (отнесение проведено по Накамото) и его соединения с молибденом (табл.1) показал, что происходят изменения в положении и интенсивности хаpактеристических полос колебаний карбоксильной и аминогрупп. Исходная аминокислота, как известно, существует в цвиттерионной форме. Об этом свидетельствует наличие колебаний, характерных для NH₃⁺-группы. Для соединения (1) характерен сдвиг полос колебаний карбоксильной группы (табл.1). Кроме того, отмечено появление в его спектре двух близких полос поглощения, отвечающих симметричным и асимметричным колебаниям Мо О связи, что служит убедительным аргументом в пользу цис-положения кратносвязанных атомов кислорода.

Изучением М_эфф. по методу Фарадея установлено, что соединение (I) диамагнитно. В УФ-спектре полоса переноса заряда лиганда под влиянием иона МоО₂²⁺ сдвигается на 1000 см^-1 (с 50000 до 49000 см^-1) и понижает свою интенсивность в 3 раза. Значение молярной проводимости соединения (I) (10,4 см²/Ом˙ моль) в этаноле немного ниже, чем значения, характерные для сильных электролитов состава 1:2, что, видимо, связано с неполной диссоциацией соединения (I) вследствие возникновения дополнительной координационной связи анион-аланина-ион МоО₂²⁺. Нагревание соединения (I) сопровождается дегидратацией (Δ m ≈ 6%) при 100^оС, что связано с потерей одной молекулы воды (Δ m расчетная 5,6%). Дальнейшее разложение сопровождается двумя экзотермическими эффектами при 160 и 330^оС. Исходная кислота начинает осмоляться при 110^оС.

Учитывая ряд факторов, во-первых, соединения, синтезированные по использованной методике [2] получаются только состава МоО₂ (L Н)₂; во-вторых, это наиболее характерный состав, когда L-лиганд с азот- и кислородсодержащими донорными атомами и аминокислотами; в-третьих, характеристики ИК-спектров, магнитное поведение и молярная проводимость в перечисленных соединениях совпадает с таковыми для соединения (I), можно провести аналогию между веществами с более детально изученной структурой и соединением (I). На основании этого считают, что диоксоди-бета-аланинато-молибден, наряду с перечисленными веществами, имеет мономерное строение с цис-конфигурацией МоО₂-фрагмента и координирует аланинат-ион по кислороду карбоксила. Биологическое действие соединения (I) определялось на мышах и кроликах. Для этого было сформировано несколько групп животных: 1 для клинически здоровые кролики (5 голов) контрольная группа; кролики с экспериментальной патологией печени (5 голов) 2-ая группа, получавшая дозу препарата 0,20 г/кг массы; кролики с экспериментальной патологией печени (5 голов), получавшие дозу препарата 0,40 г/кг массы, 3-тья группа и 4-ая группа, получавшая дозу препарата 0,60 г/кг с патологией печени. Моделирование патологии печени проводили тетрахлорметаном в дозе 1 мл 100%-ного раствора в подсолнечном масле. Контроль за состоянием животных проводили на основании клинических и морфологических исследований. Для уточнения диагноза из каждой группы по 2 животных подвергали биопсии печени, а также это позволяло делать заключение о белоксинтезирующей функции печени. Электронограммы получали на электронном микроскопе по Уикли Б. В ходе экспериментальных исследований было обращено внимание на реактивность животных от введения соединения (1) (место инъекции, кожная реакция, изменение общего состояния и мочеиспускание, дефекция и т.д.).

Гистоморфологическая характеристика печени у клинически здоровых животных (фиг. 1) активное ядро, наличие митохондрий и незначительно расширенных цистерн ГЭР). На электронограммах хорошо выявляется электронно-плотное ядро овальной формы с гетерохроматином по периферии. В центре ядра располагается несколько ядрышек, чаще одно, а также видны РНП-гранулы. В цитоплазме гепатоцита имеются органеллы: митохондрии, гранулярный и агранулярный эндоплазматический ретикулум, рибосомы, встречаются лизосомы. Кроме этих органелл имеются жировые капли, вакуоли, расположенные по всей цитоплазме. Вероятно это следствие недоброкачественного, неполноценного кормления кроликов. Гликоген встречается в незначительном количестве. Морфофункциональное состояние гепатоцита зависит от его расположения в дольке: на периферии или в центре. На васкулярном крае гепатоцита содержится незначительное количество микроворсинок, это характерно и для билиарного полюса. Гистоморфологическая характеристика печени у животных 2-ой группы (с экспериментальным хроническим гепатозом, воспроизведенным тетрахлорметаном (фиг.2). У животных 2-й группы в печени под действием гепатотропного яда развиваются изменения дистрофического и некробиотического характера. Причем ответная реакция гепатоцитов на тетрахлорметан не адекватная: отдельные в состоянии дистрофии, а другие в стадии некроза. Так, в ядре уменьшается, а в отдельных случаях исчезают ядрышки, уменьшается количество РНП-гранул. Увеличивается количество эухроматина, распавшегося на мелкие осьмиофобные гранулы. От ядpа отслаивается кариолемма, в результате чего между ними увеличивается пространство. Вначале количество и размеры митохондрий увеличивается, появляется складчатость мембран, кристы мало заметны или полностью редуцируются. В последующем эти органеллы вакуолизируются и их общее число уменьшается до полного исчезновения. Эндоплазматическая сеть становится агранулярной, а рибосомы распыляются по цитоплазме. На периферии гепатоцита цестерны сети фрагментируются и видны в виде небольших овальных везикул. В дальнейшем в гепатоцитах преобладает некробиотический характер: цитоплазма заполняется громадными вакуолями и жировыми каплями. На васкулярном и билиарном полюсах гепатоцита исчезают микроворсинки. Эндотелиоциты, звездчатые ретикулоэндотелиоциты гипертрофируются. В межсину- соидальном пространстве появляются клетки соединительной ткани, а около гепатоцитов лейкоциты. Как видно из приведенных материалов, в печени под действием тетрахлорметана развивается сосудисто-тканевая реакция, характерная для воспаления.

На фиг.2 показан гепатоцит кролика после действия четыреххлористого углерода. Расширение перинуклеарного пространства, цистерн ГЭР, уменьшение количества митохондрий, гомогенизация цитозоля.

Гистоморфологическая характеристика печени у животных 3-й группы (доза соединения (I) 0,20 г/кг) показана на фиг.3.

Кроликам с экспериментальным токсическим гепатозом ежедневно давали перорально соединение (I). Установлено, что эффект его начинается с второго дня применения. Как в ядре, так и цитоплазме развиваются компенсаторно-приспособительные реакции. В частности происходит активация ядра, незначительное увеличение РНП-гранул, а в цитоплазме уменьшается количество жировых капель и вакуолей. Однако более значительных изменений при использовании этой дозы достичь не удается. В результате чего доза суточная соединения (I) была увеличена.

Гистоморфологическая характеристика печени у животных 4-й группы (доза соединения (I) 0,40 г/кг массы) показана на фиг.4.

Кроликам с экспериментальным токсическим гепатозом ежедневно в указанной дозе давали соединение (I). Установлено, что стимулирующее действие оно оказывает с первого дня введения. В печени активируются биосинтетические процессы: появляются розетки гликогена, но наибольшее влияние соединение оказывает на белоксинтезирующий аппарат гепатоцитов. В ядре отмечается правильное расположение гетерохроматина, появляются в большом количестве РНП-гранулы, которые заполняют большую часть нуклеоплазмы. В ядре насчитывается от 1 до 3 ядрышек, а часть гепатоцитов многоядерные. В цитоплазме нормализуются отдельные мембранные органеллы. В некоторых гепатоцитах органеллы имеют обычную структуру, а в других сохраняются дистрофические процессы. В частности митохондрии увеличены в размерах, цистерны эндоплазматической сети расширены, сохраняются, хотя и в незначительном количестве вакуоли и жировые капли. Одновременно в цитоплазме увеличивается количество лизосом, аутофагосом и в несколько раз количество свободных рибосом. Через 5-10 дней применения этого соединения гистоморфологическая структура гепатоцитов до 80% от общего количества улучшается, активируется в них белоксинтезирующий аппарат, что очень важно для осуществления жизнедеятельности клетки. Для испытания более высокой дозы были проведены следующие исследования.

Гистоморфологическая характеристика печени у животных 5-й группы (доза соединения (I) 0,60 г/кг массы) показаны на фиг.5. Активизация ядра, энергетика количества микроворсинок на билиарном полюсе.

На кроликах с экспериментальным токсическим гепатозом были проведены аналогичные исследования с ежесуточной дачей соединения. Отмечено, что компенсаторно-приспособительные и регенеративные процессы в гепатоцитах усиливаются и соответствуют во многом ультраструктурным характеристикам, полученным при использовании дозы 0,40 г/кг. Следует отметить, что при этой дозе в цитозоле появляются осьмиофильные гранулы, что возможно связано с освобождением из соединения (1) молибдена и накоплением его в гепатоцитах. В связи с этим увеличение доз соединения (1) было прекращено и выявлено, что наиболее пригодна для стимуляции белоксинтезирующих органелл гепатоцита доз 0,40 г/кг массы животного.

Таким образом, предложенное соединение (I) оказывает выраженное действие на структуру и функцию печени. Соединение (I) оказывает выраженное действие на гепатоциты: в них увеличивается количество митохондрий, лизосом, нормализуется эндоплазматическая сеть и значительно активируется ядро и ядрышко. Перечисленные изменения в печени способствуют улучшению пластических и энергетических функций, что соответствует достижению поставленной цели.

Широкий спектр действия соединения (1), малая токсичность, доступность позволяет без особых трудностей применять в качестве лечебного средства, для лечения и профилактики токсических поражений печени, что на сегодняшний день является актуальным.

Известная методика ситеза отличается от использованной в изобретении и позволяет получить другие соединения. В основе метода, использованного в заявленной работе, синтез соединения (I) осуществляется в две стадии. По первой стадии процесс идет, видимо, с образованием оксалатного комплекса по уравнению MoO₃+2H₂C₂O₄·2HO __→ MoO(C₂O₄)₂×H₂O (a) Доказательством того, что синтез идет с образованием соединения (а) является: экспериментальное определение молекулярной массы выделенных кристаллов (а), равное 316 г против 324 г, вычисленных для состава МоО(С₂О₄)₂ ˙2Н₂О;
содержание Мо(VI) 29,3 ± 0,1(%) (29,6% выч.);
отнесение характеристических полос ИК-спектра соединения (а) в соответствии с Накамото ν_аs (C= O) 1720, 1688; ν_s (C=O) 1410; ν_s (C=O+ δ(O-C=O) 1228; δ (O-C=O)+деф. кольца 480;(Мо-О)_конц.+ δ(О-С=О) 372,404 (см^-1).

Необходимо отметить, что ν (Мо-О)мостик. отмеченные [2,3,4] при 590, 730, 761 см^-1 не наблюдаются;
ЯМР ¹³С соединения (а) характеризуется единственным сигналом при 164,26 м. д. что является свидетельством симметричности структуры, поскольку известно, что сигналы одинаково экранированных ядер совпадают.

Уравнение реакции, лежащее в основе второй стадии,
MoO(C₂O₄)₂·H₂O+2NH₂(CH₂)₂COOH __→ MoO₂[OOC(CH)₂NH₂]₂+2H₂C₂O₄ Методика выделения получившихся соединений.

В результате синтеза по этой стадии вначале выделяются крупные прозрачные кристаллы, которые по элементному составу, молекулярной массе (экспериментально определенной) соответствуют щавелевой кислоте. Последние могут содержать 0,3-0,6% Мо (VI), видимо, за счет адсорбции Мо-содержащих соединений. Затем из маточного раствора выделяли заявляемое соединение (I). Для того, чтобы оно содержало меньше примесей соединения (а), выделение соединения (I) проводили из бесцветного маточного раствора (полученного после отделения кристаллов соединения (а)) после дополнительного упаривания 930-40^оС) и охлаждения. Выделялись мелкие голубоватые кристаллы соединения (I), которые через 2 сут отделили от насыщенного раствора. Операцию повторяли 3-4 раза. С каждым разом остающийся маточный раствор становился более синим и вязким, так что в последующем не представлялось возможным выделить соединение (I) из пастообразной массы. Однако в результате многодневного высушивания (≈ 30 дней) при 45-55^оС в смеси появились светлые кристаллы. Из образовавшейся массы удалось выделить белое вещество не растворимое в спирте, которое по свойствам сильно отличается от заявляемого соединения:
а) ИК-спектры имеют индивидуальные полосы ν (ОН), ν(NH₂),ν (COOH) и многочисленные ν (Мо-О);
б) имеют спектры ПМР ¹Н и ЯМР ¹³С, отличные от соединения (I);
в) температура плавления (с разложением) отличается от таковой для соединения (I);
г) имеет другой элементный состав (содержание Мо (VI) выше). По перечисленным свойствам это соединение, в котором два атома Мо связаны через мостики карбоксил- и оксалат-ионов, т.е. соединение подобное описанным [1-4] может быть получено, но это совсем другое вещество с другими химическими свойствами.

В дополнении к изложенному в заявке интересно отметить следующие особенности ИК-спектров соединения (I). Сопоставляя ИК-спектры соединения (а) и (I), удалось выявить δ_s NH₂ при 1524 см^-1, присущую только соединению (I) и отсутствующую в оксалатном комплексе, а также отнести полосы при 1080 и 840 к ν CCN. Это позволило определеннее говорить о ν_as COO (см. табл.3). Некоторое смещение ν_as COO в низкочастотную область относят за счет перераспределения электронной плотности в структуре лиганда при координации β-аланина через бидентантную карбоксигруппу.

Спектры ПМР ¹Н (м.д.) 3,34 т; 3,72 т (триплеты от группы СН₂) и широкая полоса с макс. 4,72; ЯМР ¹³С 177,14; 167,90 (группы СООН), 33,649; 33,634 (СН₂). Количество этих полос свидетельствует о симметричности структуры соединения. Небольшой диамагнитный сдвиг наблюдаемый для сигналов ¹³С, проявившийся в спектрах ЯМР, снятых с внешним стандартом, по сравнению со спектром β-аланина свидетельствует о большей вероятности координации по бидентатаному карбоксилу.

Содержание азота в соединении (I) 8,48%
Эффективность биологического действия соединения (I) по сравнению с эталоном приведена в табл.2.

Формула изобретения

Диоксоди-бета-аланинато-молибден формулы

проявляющий свойства гепатопротектора.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8