Способ определения электрононасыщенного ароматического амина, являющегося маркером содержания аналита в биологической жидкости, и средство для его осуществления

 

Использование: в медицине, для определения аналита при помощи образования гетерополисинего. Сущность: аналит превращают с веществом, которое приводит к электрононасыщенному амину, который вступает в контакт с труднорастворимой солью гетерополикислоты. Средство для осуществления способа содержит труднорастворимую соль гетерополикислоты в количестве, достаточном для перевода всего амина в гетерополисиний. 2 с и 2 з. п. ф-лы, 7 ил., 4 табл.

Изобретение относится к способу определения аналита при помощи образования гетерополисинего и к подходящему для этого средству, т.е. к применению труднорастворимой соли гетерополикислоты для определения аналита. Изобретение относится также к применению труднорастворимой соли генерополикислоты для получения средства для определения аналита. Изобретение относится также к применению труднорастворимой соли гетерополикислоты для получения определения аналита образованием гетерополисинего.

Гетерополикислоты представляют собой неорганические поликислоты по меньшей мере с двумя различными центральными атомами. Они образуются из многоосновных кислородных кислот металла (молибден, вольфрам, ванадий) и неметалла или металла (фосфор, кремний, мышьяк, йод, железо, марганец, кобальт, как частичные смешанные ангидриды). Примерами являются фосформолибденовая или фосфорвольфрамовая кислота. Гетерополикислоты водорастворимы. Однако они устойчивы только в кислом растворе.

Гетерополикислоты молибдена и вольфрама являются известными реактивами. Аналитическое применение они находят для определения фосфата и для обнаружения арсената или силиката образованием соответствующих гетерополикислот с молибдатом или вольфрамом и последующим восстановлением гетерополикислоты до синего красителя, так называемого гетерополисинего. Окраска основывается на светопоглощении в результате перехода электронов между пятивалентным и шестивалентным состоянием молибдена или вольфрама. Гетерополисиний из гетерополикислот является красителем высокой экстинкции, который в зависимости от длины волны имеет очень широкий максимум абсорбции. Это типично для полос поглощения переноса зарядов.

Гетерополикислоты для обнаружения восстанавливающихся соединений в результате образования гетерополисинего известны. Например (Spot Tests in Organic Analysis, F. Feigl, Elsevier Publishing Company, 1956, с. 128, 129), фосфорную кислоту восстанавливают многими восстанавливающими соединениями до молибденовой сини. Так как эта реакция обнаружения неспецифична, для достижения определенной селективности рекомендуется сделать исследуемую пробу щелочной и затем экстрагировать простым эфиром. В этом случае эфирный экстракт содержит ароматические азотистые основания и растворимые в простом эфире нейтральные вещества. Кислотные вещества остаются растворенными в водной фазе.

Известно (Issopoulos, Pharm. Asta Helv. 1989, N. 64, с. 82), что определенные лекарственные средства, которые содержат структуру о-гидрохинона, например метилдопа в сернокислотном растворе, оказывают восстанавливающее действие на молибденфосфорную кислоту и приводят к образованию молибденовой сини.

Известно (М. L.Mafheke и др. Clin. Chem. 1987, N 33, с. 2109-2110) применение фосфорвольфрамовой кислоты для обнаружения мочевой кислоты. Восстановительное образование вольфрамового голубого служит индикатором для мочевой кислоты. Реакции обнаружения препятствует присутствие лекарственных средств с восстанавливающим действием.

Известно определение глюкозы в сыворотке крови или в плазме, которое основывается на следующей последовательности реакций. Глюкозу окисляют гексацианоферратом калия (III). Полученный гексацианоферрат калия (II) оказывает восстанавливающее действие на фосформолибденовую кислоту и приводит к образованию молибденовой сини. Так как сыворотка крови и плазма могут содержать различные количества мочевой кислоты, лекарственных средств и других веществ с восстанавливающим действием, например билирубина и глютатиона, их нарушающее влияние при этом способе предварительно запрограммировано.

Недостаток всех известных до сих пор аналитических методов, которые используют восстановительное образование гетеpополисинего из гетерополикислот, заключается прежде всего в неспецифичности соответствующей реакции обнаружения. Очень многие восстанавливающие вещества могут действовать как помеха, так как они тоже приводят к образованию гетерополисинего. Дополнительно гетерополикислоты являются стойкими только при кислых условиях. Это очень сильно ограничивает область применения. В частности, связывание образования гетерополисинего с ферментативными стадиями реакции для специфического обнаружения и для специфического определения веществ до сих пор не известно. Но для обнаружения компонентов жидкостей организма, таких как кровь, сыворотка крови, плазма, моча и т.д. часто необходимы ферментативные способы определения.

Цель изобретения использование образования гетерополисинего как реакции обнаружения и определения веществ в жидкостях организма, и особенно в комбинации ферментативными стадиями реакции. Оказывающее восстановительное действие вещества не должны действовать как помеха. Реакция обнаружения и определения должна протекать при требуемой для ферментативных реакций величине рН. Кроме того, можно быстро осуществлять реакции обнаружения и определения.

Было установлено, что труднорастворимая соль гетерополикислоты может выгодно применяться для определения аналита, особенно тогда, когда аналит представляет электронасыщенный ароматический амин или он вместе с другим веществом приводит к такому.

Способ определения аналита при помощи образования гетерополисинего отличается тем, что аналит превращают с веществом, которое ведет к образованию электрононасыщенного ароматического амина, который контактирует с труднорастворимой солью гетерополикислоты. Способ можно использовать также для определения самого электрононасыщенного ароматического амина, причем раствор этого амина контактирует с труднорастворимой солью гетерополикислоты. Применяется труднорастворимая соль гетерополикислоты для получения средства для определения аналита в результате образования гетерополисинего.

Средство для определения аналита образованием гетерополисинего отличается тем, что оно содержит вещество, которое при взаимодействии с аналитом приводит к электрононасыщенному ароматическому амину и, кроме того, труднорастворимую соль гетерополикислоты или вещество, обеспечивающее получение такой соли при взаимодействии. Если средство должно служить непосредственно для определения электрононасыщенного ароматического амина, достаточно, если оно содержит труднорастворимую соль гетерополикислоты или образующие такую соль при взаимодействии вещества в жидкой среде или в связанной с носителем форме.

Согласно изобретению труднорастворимая соль гетерополикислоты может применяться для определения аналита. Под труднорастворимой солью гетерополикислоты подразумевается, прежде всего, такая соль гетерополикислоты, которая в воде или водных средах, таких как буфер или жидкости организма, например кровь, плазма, сыворотка крови, мочи или слюна, совсем не растворима или только очень малорастворима, и это сохраняется также в условиях испытания и окрашивания. В частности, соль гетерополикислоты так плохо растворима, что максимально растворимое в жидкой пробе количество было бы одно недостаточно для определения содержащегося в нем аналита.

Такая труднорастворимая соль гетерополикислоты оказалась стойкой не только в кислой, но и в нейтральной и основной области рН, особенно приблизительно до рН 10. Следовательно, ее можно применять в областях рН, где большинство ферментов являются активными и тем самым используются для образования гетерополисинего в комбинации с ферментативными реакциями. В нерастворенном состоянии труднорастворимая соль гетерополикислоты по изобретению является стойкой и при повышенной температуре. Несмотря на плохую растворимость, аналит при помощи соли гетерополикислоты по изобретению можно очень быстро, т. е. в течение от нескольких секунд до нескольких минут, обнаруживать и определять благодаря образованию гетерополисинего. При этом селективное определение без помех возможно благодаря другим веществам с восстанавливающим действием. Это позволяет чувствительный метод измерения, который ввиду широкого максимума абсорбции образованного гетерополисинего, который составляет от приблизительно 550 до свыше 1100 нм, не предъявляет никаких особых требований к измерительным приборам и поддается хорошему визуальному наблюдению.

Примененные по изобретению соли гетерополикислот представляют соли гетерополикислот молибдена, молибдена и вольфрама, ванадия, и молибдена или ванадия, и молибдена, и вольфрама с фосфором, мышьяком, кремнием или германием в качестве гетероатомов. Особенно предпочтительны гетерополикислоты молибдена с фосфором или мышьяком. Фосфор как атом неметалла особенно предпочтителен. В качестве атома металла предпочтителен молибден. Исключительно пригодны труднорастворимые соли 12-молибденфосфорной кислоты, 18-молибдендифосфорной кислоты, 12-молибденмышьяковой кислоты, 18-молибденмышьяковой кислоты, 11-молибдо-1-ванадофосфорной кислоты, 10-молибдо-2-ванадофосфорной кислоты и 9-молибдо-3-ванадофосфорной кислоты, причем особенно предпочтительна 18-молибдодифосфорная кислота на основании своего высокого выхода крашения при восстановлении до молибденовой сини.

Труднорастворимые соли гетерополикислот представляют такие соли, у которых катионы больше, чем ион аммония NH₄⁺. Предпочтительные катионы могут быть представлены общей формулой (1): R¹R²R³R⁴X⁺ (1), в которой R¹, R², R³ и R⁴ одинаковые или различные и обозначают алкильный, арильный или аралкильный остаток, или водород, если не все остатки одинаковые, или причем два остатка вместе образуют алкиленовый остаток; Х атом фосфора или азота.

В алкильных и аралкильных остатках алкил обозначает 1-22 атома углерода, предпочтительно содержащий 1-6 атомов углерода остаток с прямой или разветвленной цепью. Арил в арильных или аралкильных остатках обозначает ароматический остаток из 6-10 атомов углерода. Особенно предпочитают фенил или нафтил. В качестве аралкильного остатка предпочтительна бензиловая группа.

Алкиленовый остаток представляет насыщенную или ненасыщенную углеводородную цепь из 4-6, предпочтительно 4 или 5 атомов углерода, которая обоими концами связана с Х. Катионы формулы (1) могут содержать два таких алкиленовых остатка. Однако предпочтительно имеется только один алкиленовый остаток.

В формуле (1) Х обозначает предпочтительно атом азота. Предпочтительными катионами в труднорастворимых солях могут быть также катионы из группы содержащих четвертичный N-атом гетероатома азота, например пиридин или хинолин, в которых атом азота связан с алкильным, арильным или аралкильным остатком. Для определения этих остатков действительно также определение остатков R¹, R², R³ и R⁴ в формуле (1).

Труднорастворимую соль гетерополикислоты по изобретению можно получать, например, превращением гетерополикислоты с соответствующим основным веществом. Для этого применяют по меньшей мере одно вещество в виде раствора, предпочтительно водного раствора. Но можно также обе солевые компоненты в твердой форме добавлять к жидкости, особенно к водной жидкости, или наоборот.

Аналитом называют определяемое вещество. Изобретение особенно пригодно для веществ, которые растворены в жидкости, особенно в водной жидкости. Особенно выгодно можно применять труднорастворимую соль гетерополикислоты для определения веществ в жидкостях организма, таких как кровь, плазма, сыворотка крови, моча или слюна. Возможными аналитами в этом смысле являются глюкоза, холестерин, лактат, NADH или этанол. По изобретению можно определять все те соединения, которые вместе с одним или несколькими другими соединениями могут быть превращены в такие вещества или они сами являются такими веществами, которые относительно своего окислительно-восстановительного потенциала и своей кинетики способны восстанавливать труднорастворимую соль гетерополикислоты от нескольких секунд до нескольких минут до гетерополисинего. Оказалось, что электрононасыщенные ароматические амины могут это делать. Неожиданным является то, что селективное определение без помехи возможно благодаря другим соединениям с восстанавливающим действием.

Под электрононасыщенным ароматическим амином понимают соединение, которое является более электрононасыщенным, чем анилин, и представляет тем самым более сильный восстановитель, чем анилин. Электрононасыщенные ароматические амины имеют окислительно-восстановительный потенциал менее 0,6 В, предпочтительно менее 0,45 В относительно нормального водородного электрода. Однако величина одного окислительно-восстановительного потенциала не является решающей. Важно, чтобы соответствующее вещество быстро, т.е. в течение менее приблизительно трех минут, могло восстанавливать труднорастворимую соль гетерополикислоты до гетерополисинего. Принимают во внимание, например, все производные анилина, которые содержат один или несколько +1 и/или +М-заместителей, как гидрокси-, алкил-, алкокси-, арилокси-, алкилтио-, арилтио-, амино-, моноалкиламино-, и диалкиламино остатки.

Алкил-, алкокси-, алкилтио-, моноалкиламино- и диалкиламиноостатки представляют остатки, в которых алкил является углеводородным остатком с 1-6 атомами углерода, который может быть замещен гидроксигруппой, замещен в случае необходимости однократно или многократно алкилом с 1-6 атомами углерода аминогруппой, РО₃Н₂, SО₃Н и СО₂Н. Кислотные остатки РО₃Н₂, SО₃Н₂ и СО₂Н могут существовать как таковые или в форме солей, таких как соли аммония, щелочных или щелочноземельных металлов.

Арилокси- и арилтиоостатки представляют собой остатки с 6-10 атомами углерода, предпочтительно фенокси- и фенилтиоостатки.

Под производными анилина понимают также соединения, которые содержат незамещенную или замещенную однократно или многократно алкилом аминогруппу на ароматической циклической системе, которая анеллирована с одним или несколькими ароматическими и/или алициклическими кольцами. В качестве ароматических колец принимают во внимание как углеродароматические системы, так и гетероатомы. Примерами являются анеллированные бензольные кольца или нафталиновые кольца или анеллированное пиридиновое кольцо.

Под алициклическими кольцами понимают насыщенные или ненасыщенные циклоалифаты с 5-7 атомами углерода, предпочтительно с 5 или 6 атомами углерода.

Возможными алкильными заместителями аминогруппы могут быть углеводородные остатки с 1-6 атомами углерода, которые могут быть замещены гидроксигруппой, замещенной в случае необходимости однократно или многократно алкилом с 1-6 атомами углерода аминогруппой, РО₃Н₂, SО₃Н и СО₂Н. Кислотные остатки РО₃Н₂, SО₃Н и СО₂Н могут существовать как таковые или в форме соли, такой как соли аммония, щелочных или щелочноземельных металлов.

Особенно пригодными в качестве электрононасыщенных ароматических аминов являются соединения общей формулы (II) RN (II), в которой R⁵ гидрокси- или амино-, причем аминогруппа замещена в случае необходимости однократно или двукратно алкильным остатком и алкильный остаток замещен в случае необходимости гидроксигруппой, аминогруппой, замещенной в случае необходимости однократно или многократно алкилом, РО₃Н₂, SО₃Н или СО₂Н; R⁶ и R⁷ одинаковые или различные, представляют водород или алкил, причем алкильный остаток в случае необходимости замещен гидроксигруппой, аминогруппой, замещенной однократно или многократно алкилом, РО₃Н₂, SО₃Н или СО₂Н; R⁸, R⁹, R¹⁰ и R¹¹ одинаковые или различные и обозначают водород, алкил, алкокси-, алкилтио-, арилтио-, галоген, карбокси-, карбоксиалкил или алкоксикарбонил. Алкильные остатки и алкил в алкилтио, карбоксиалкил и алкоксикарбонилостатках представляют углеводородные остатки с 1-6 атомами углерода. Предпочтительны остатки с 1-3 атомами углерода.

Алкоксиостатки также представляют углеводородные остатки с 1-6 атомами углерода. Особенно предпочтительны остатки с 1-3 атомами углерода. Арилокси- и арилтиоостатки представляют остатки с 6-10 атомами углерода, причем особенно предпочитают фенокси- и фенилтиоостатки. Галоген обозначает фтор, хлор, бром или йод. Хлор и бром являются предпочтительными галоидными заместителями.

Кислотные остатки РО₃Н₂, SО₃Н или СО₂Н могут существовать как таковые или в форме соли, такой как соль аммония, щелочного металла или щелочноземельного металла.

Солями аммония являются такие, которые содержат ион аммония NH₄⁺, или такие, которые содержат замещенные однократно или многократно алкильными, арильными или аралькильными остатками катионы аммония. Алкил в алкильных и аралькильных остатках обозначает углеводородный остаток с 1-6 атомами углерода. Арил в арильных и аралкильных остатках представляет содержащую 6-10 атомов углерода ароматическую циклическую систему, предпочтительно фенил. Предпочтительным аралкильным остатком является бензил. Солями щелочных металлов является предпочтительно соли лития, натрия или калия. Соли щелочноземельных металлов представляют предпочтительно соли магния и кальция.

Электрононасыщенные ароматические амины можно определять непосредственно с труднорастворимой солью гетерополикислоты в результате образования гетерополисинего. Но можно определять также вещества, которые химической или ферментативной реакцией с другим веществом превращают последнее стехиометрическим образом до электрононасыщенного ароматического амина. Например, в качестве компонентов реакции можно применять такие вещества, которые уже содержат основной каркас электрононасыщенного ароматического амина и у которых он может освобождаться химической или ферментативной реакцией с определяемым аналитом. Под этим понимают предпочтительно такие соединения, которые в результате гидролиза приводят к электрононасыщенному ароматическому амину, например амиды, сложные эфиры или гликозиды электрононасыщенных ароматических аминов. Аналиты, которые можно таким путем определять, представляют предпочтительно ферменты, которые катализируют превращение соответствующих субстратов в электрононасыщенные ароматические амины, особенно гидролазы как расщепляющие амидные связи и/или пептидные связи ферменты, эфирные связи (хотя бы расщепляющие связи карбоновой кислоты, фосфорной кислоты или серной кислоты ферменты) и расщепляющие гликозидные связи ферменты, кроме того, трансферазы, которые катализируют перенос групп, например γ-глютамилтрансфераза.Можно определить также вещества, которые могут окислять ферментативно и при этом применять в качестве акцепторов электронов такие вещества, которые дают в результате окисления электрононасыщенные ароматические амины. Для веществ в жидкостях организма, таких как кровь, плазма, сыворотка крови, моча или слюна, известно множество оксидоредуктаз, которые опознают специфически определенные вещества и в присутствии функционирующего акцептора электронов окисляют эти вещества. В качестве примеров следует назвать зависящие от флавина оксидазы, такие как L- и D-монокислота-оксидаза. холестерин-оксидаза, глюкоза-оксидаза, глицерин-3-фосфат-оксидаза, лактат-оксидаза, или пируват-оксидаза и не зависящие от NAD(P) (амидадениндинуклеотидфосфат никотиновой кислоты) дегидрогеназы, как зависящая от пирролохинолин-хинона глюкоза-дегидрогеназа или диафораза (NADH: dye-оксидоредуктаза).

В случае оксидоредуктаз, особенно при оксидазах и не зависящих от NAD(P)-дегидрогеназах, применяют акцепторы электронов для ферментативных окислений, которые в результате ферментативного окисления ферментного субстрата восстанавливаются до электрононасыщенного ароматического амина. Такие вещества, которые ферментативно окисляются, можно обнаруживать и определять контактированием образующегося электрононасыщенного ароматического амина с труднорастворимой солью гетерополикислоты образованием гетерополисинего.

В качестве выгодных акцепторов электронов следует назвать ароматические нитрозосоединения, оксимы и гидроксиламины. Особенно предпочтительны ароматические нитрозосоединения и оксимы.

Для определения аналита по изобретению образованием гетерополисинего достаточно аналит путем реакции с веществом превратить в электрононасыщенный ароматический амин и ввести в контакт с труднорастворимой солью гетерополикислоты. Если электрононасыщенный ароматический амин сам является непосредственно определяемым аналитом, последний без предшествующих химических или ферментативных реакций вступает в контакт с труднорастворимой солью гетерополикислоты. Воздействующий на соль гетерополикислоты электрононасыщенной ароматический амин существует в растворенной форме, предпочтительно в водном растворе, например воде, буферном растворе или жидкости организма. Когда определяемый аналит сам не является электрононасыщенным ароматическим амином, выгодно чтобы необходимое вместе с аналитом для образования электрононасыщенного ароматического амина соединение было также растворено в водной жидкости. Его можно добавлять к пробе перед контактированием с труднорастворимой солью гетерополикислоты или даже под конец. Какую последовательность выбирают, зависит от конкретного случая и может решаться специалистом для проводимого определения аналита на основании его общих профессиональных знаний или благодаря нескольким оптимирующим опытам. Необходимое для образования электрононасыщенного ароматического амина вещество можно добавляют в водную пробу в твердой или растворенной форме.

Дающее вместе с определяемым аналитом электрононасыщенный ароматический амин вещество должно контактироваться с пробой по меньшей мере в таком количестве, чтобы весь аналит мог вступать в реакцию. Предпочтительно применяют 2-10-кратный избыток.

Труднорастворимая соль гетерополикислоты может вступать в контакт с исследуемой пробой как твердое вещество. Но она может также существовать как суспензия в жидкости, предпочтительно в водной жидкости. В этом случае для определения суспензию смешивают с исследуемой пробой. В присутствии определяемого аналита образуется труднорастворимый в воде гетерополисиний, который можно определить по его интенсивной окраске. Для количественного определения можно труднорастворимый в воде гетерополисиний и непревращенную соль гетерополикислоты отделять от жидкости, например, центрифугированием, затем в подходящем растворителе, например диметилсульфоксиде, растворять и фотометром в случае необходимости при использовании стандартных растворов или калибровочных кривых измерять концентрацию гетерополисинего красителя и тем самым определять концентрацию обнаруживаемого аналита.

Труднорастворимая соль гетерополикислоты должна присутствовать в таком количестве, чтобы имеющийся в пробе или образованный электрононасыщенный ароматический амин приводил к образованию гетерополисинего, которое можно количественно связать с количеством определяемого аналита или электрононасыщенного ароматического амина. Поэтому следует применять такое количество труднорастворимой соли гетерополикислоты, чтобы до максимальной соответствующей концентрации электронасыщенного ароматического амина повышение количества амина приводило к увеличению количества гетерополисинего.

Средство для определение аналита образованием гетерополисинего содержит вещество, которое при взаимодействии с аналитом приводит к электрононасыщенному ароматическому амину, и труднорастворимую соль гетерополикислоты. Такое средство можно применять, например, как суспензию или как лиофилизат, смесь порошков или прессованную таблетку. Компоненты могут существовать рядом друг с другом или отдельно. Каждый из компонентов может быть переработан в целесообразной форме. Средство может содержать отдельно не готовую к употреблению труднорастворимую соль гетерополикислоты, а только необходимые для приготовления такой соли компоненты, а именно гетерополикислоту и катионное или основное соединение, которые контактируют непосредственно перед реакцией определения по изобретению и лишь потом соответствующую соль. Особенно выгодно, если средство по изобретению содержит труднорастворимую соль гетерополикислоты в тонкодисперсной форме, так что она имеет большую реакционноспособную поверхность. В случае необходимости средство по изобретению может содержать такие реактивы, как буферный раствор и вспомогательные вещества, например стабилизаторы, образователи каркаса и т.д. Если определяемый аналит сам является электрононасыщенным ароматическим амином, не требуются никакие вещества, которые лишь с аналитом приводят к электрононасыщенному ароматическому амину.

Целесообразно определять аналит при помощи так называемого сухого теста. Известные устройства, которые применяются для осуществления сухого теста, можно назвать носителями теста. Необходимые для осуществления теста реактивы существуют в сухой, т.е. не растворенной в жидкости, форме, например в или на впитывающем материале: на бумаге, открытой пленке по ЕР-А-0 016 387, на стекловолокнистом холсте или на пористой синтетической мембране, или в или на способном к набуханию материале, например на соответствующей синтетической пленке, желатине или целлюлозе.

При подаче жидкости пробы на носитель теста или при погружении носителя теста в жидкость пробы в носителе теста образуется жидкая среда, внутри которой протекает реакция обнаружения. Вызванное реакцией окрашивание можно оценивать визуально или при помощи фотометра, например отражательного фотометра.

Для получения средства по изобретению в связанной с носителем форме подходящий материал-носитель (фильтровальную бумагу, целлюлозу или холст из искусственного волокна) пропитывают растворами или/и суспензиями необходимых, примененных для получения носителей теста реактивов в легколетучих растворителях, например воде, метаноле, этаноле или ацетоне. Это можно осуществлять в стадии пропитки. Часто бывает целесообразно осуществлять пропитывание в нескольких стадиях, причем применяют растворы или/и суспензии, которые соответственно содержат часть компонентов готового средства. Например, можно наносить на материал-носитель в первой стадии из суспензии труднорастворимую соль гетерополикислоты и во второй стадии из раствора вещество, которое с определяемым аналитом приводит к электрононасыщенному ароматическому амину и содержит в случае необходимости буферный раствор и другие добавки. Обработанный таким образом материал-носитель можно применять как таковой или известным образом наклеивать на грифы или на жесткие синтетические пленки, чтобы лучше ими манипулировать.

Вместо многократного пропитывания того же самого материала-носителя реактивы средства по изобретению можно распределять на различных материалах-носителях, которые при определении аналита приводятся в контакт друг с другом, возможный благодаря жидкостному обмену.

Для получения связанных с носителем испытываемых средств вместо пропитывания можно получать также из пленкообразователей, т.е. из полимеров или из полимерных дисперсий, растворы, которые являются такими вязкими, что из них такими известными способами получения, как раклей, прокатыванием покрытия и т.д. можно получать пленки. В эти растворы вводят реактивы и в случае необходимости буферные вещества и вспомогательные вещества. Составы для покрытий наносят на пленки-носители, сушат и готовые пленки перерабатывают в испытательные ленты.

Примеры для предпочтительных носителей теста представлены на фиг. 1 и 6. Остальные рисунки 2-5 и 7 показывают графики, которые дают зависимости отражения в процентах от времени, длины волны или концентрации аналита, которые были получены с носителями теста по фиг. 1 или фиг. 6.

На фиг. 1 показан предпочтительный носитель теста, поперечное сечение; на фиг. 2 диаграмма зависимости отражения от времени после подачи пробы на носитель теста по фиг. 1 для проб а-е с различными концентрациями глюкозы; на фиг. 3 диаграмма зависимости отражения от измеряемой длины волны для проб а-е с различными концентрациями глюкозы при применении носителя теста по фиг. 1; на фиг. 4 диаграмма зависимости отражения от концентрации глюкозы при измерении с носителем теста по фиг. 1; на фиг. 5 диаграмма зависимости отражения от NADH-концентрации при измерении с носителем теста по фиг. 1; на фиг. 6 вариант носителя теста, поперечное сечение; на фиг. 7 диаграмма зависимости отражения от концентрации этанола при измерении с носителем теста по фиг. 6.

П р и м е р 1. Обнаружение глюкозы с 18-молибдодифосфатом. Получают носитель теста по фиг. 1. Он состоит из полиэфирной пленки толщиной 350 мкм ("Мелинекс", "Импириэл кемикл индастриз", Франкфурт, ФРГ) в качестве пленки-носителя 1 с размерами 2х3 см. В центре пленки находится отверстие диаметром 6 мм. При помощи передающегося клея 2 носитель 6 реактива, состоящий из прозрачной поликарбонатной пленки 5 толщиной 200 мкм ("Покалон", "Лонза", "Райнфельден", ФРГ), первого слоя 4 реактива и второго слоя 3 реактива, закрепляют над отверстием в пленке-носителе таким образом, что поданная через это отверстие жидкость пробы сначала контактирует со вторым слоем реактива. Носитель реактива имеет размеры 2х1 см.

Носитель 6 реактива получают следующим образом.

Первый слой реактива: 113 г бидистиллированной воды, 36,3 г 2-ного ксантана ("Келтрол F", "Келко", "Оклахома", США) в 0,2 М цитратном буферном растворе, рН 7,0, 69 г пропиофана 70 D ("БАСФ", "Людвигсхафен", ФРГ), 15 мл 15-ного нонилсульфата в воде, 6 г поливинилпирролидона ("Коллидон 25", "БАСФ", "Людвигсхафен", ФРГ), 3,9 г тетрабутиламмонийхлорида, 12 г 18-молибдодифосфорной кислоты (Справочник препаративной неорганической химии. Штуттгарт: Энке, 1954) в 15 г воды, 63 г Целатом MW 25 ("Eagle Picher", Цинциннати, Огайо, США) перемешивают до однородной массы и толщиной 150 мкм наносят покрытие раклей на прозрачную пленку 5, сушат 1 ч при 60^оС.

Второй слой реактива: 20 г бидистиллированной воды, 16 г двуокиси титана RW 56 ("Кроноз-Титан ГмбХ", Леверкузен, ФРГ), 36,3 г 2-ного Келтрола F ("Келко", Оклахома, США) в 0,2 М цитратном буферном растворе, рН 6,0, 69 г пропиофана 70 D ("БАСФ", "Людвигсхафен", ФРГ), 15 мл 15%-ного нонилсульфата натрия в воде, 6 г Коллидона 25 ("БАСФ", "Людвигсхафен", ФРГ), 188 г воды, 63 г Целатома MW 25 ("Eagle Picher", Цинциннати, Огайо, США), 400 мг N,N-бис-(2-оксиэтил)-р-нитрозоанилина х НСl в 20 г воды, 2 г глюкозооксидазы (200 ед./мг) в 12 г воды перемешивают до однородной массы и толщиной 400 мкм наносят покрытие раклей на первый слой реактива. Пузырьки воздуха удаляют слабой обдувкой и сушат покрытие 1 ч при 60^оС.

К моменту t 0 человеческую плазму с: а) 0 мг глюкозы/дал, б) 47,5 мг глюкозы/дал; в) 108,7 мг глюкозы/дал; г) 200,8 мг глюкозы/дал; д) 392,3 мг глюкозы/дал и е) 766 мг глюкозы/дал подают на описанный выше носитель теста. При 950 нм измеряют ремиссию в процентах. Первое измерение производят через 8 с, остальные измерения в четырехсекундном такте (фиг. 2). Окрашивание и уменьшение ремиссии (R) уже при первом измерении почти полное. Получается стабильная конечная величина, которую можно измерять почти к любому моменту после старта.

Если с носителем теста по фиг. 1, изготовленным как описано выше, измеряют пробы с концентрацией глюкозы а) 0 мг/дал, б) 100 мг/дал, в) 240 мг/дал и г) 800 мг/дал при различных длинах волн и наносят ремиссию (R) в процентах относительно длины волны (λ ) в нм, получают диаграмму (фиг. 3). Как поясняют изображенные так спектры, для измерения концентрации глюкозы можно применять любые длины волн между 550 и более 1100 нм. Ввиду исключительно ровного спектра допуск для колебаний измеряемой длины волны очень высокий.

П р и м е р 2. Специфичность обнаружения глюкозы с 18-молибдодифосфатом.

Приведенные в табл. 1 примесные вещества в указанных концентрациях добавляют к человеческой плазме с: а) 0 мг глюкозы/дал (С 0) и б) 110 мг глюкозы/дал (С 110 мг/дал). Если такую человеческую плазму исследуют с носителем теста по фиг. 1, который изготовлен, как в примере 1, при 660 нм находят указанные в табл. 1 величины ремиссии.

Независимо от концентрации глюкозы в человеческой плазме (0 и 110 мг/дал) не находят никаких значительных нарушений.

С носителем теста по фиг. 1, который изготавливают аналогично примеру 1 и который идентичен с описанным там носителем теста, за исключением применения тетрабутиламмонийхлорида, который для сравнительного носителя теста опускается, получают очень плохо воспроизводимые, с очень большим разбросом результаты, так как примененная 18-молибдодифосфорная кислота при величинах рН более 5,5 разлагается. Кроме того, восстанавливающие вещества действуют здесь как помехи из-за дополнительного окрашивания.

П р и м е р 3. Носитель теста для обнаружения глюкозы на основе 12-молибдофосфата. Если в рецептуре примера 1 18-молибдодифосфорную кислоту заменяют таким же количеством 12-молибдофосфорной кислоты ("Fkuka", "Buchs", Швейцария), то получают носитель теста с более слабым окрашиванием в присутствии глюкозы, который особенно хорошо пригоден для повышенных концентраций глюкозы. При применении проб с различной, но известной концентрацией глюкозы и при измерении соответствующей ремиссии в процентах при 650 нм получают кривую, изображенную на фиг. 4. Если измеряют при 950 нм, получают идентичную кривую. Подобные результаты получают с 12-молибдоарсенатом (Y), 18-молибдодиарсенатом (Y), 11-молибдо-1-ванадофосфатом, 10-молибдо-2-ванадофосфатом и 9-молибдо-3-ванадофосфатом. Из табл.2 можно получить название и формулу гетерополикислоты и максимум поглощения соответствующего гетерополисинего.

П р и м е р 4. Носитель теста для определения NAD(P)H. Если в рецептуре примера 1 глюкозооксидазу заменяют таким же количеством диафоразы, то получают носитель теста для обнаружения NA(P)H. Из проб с известной концентрацией NADH и при измерении реакции в процентах при 660 нм получается кривая, изображенная на фиг. 5. Эта кривая может служить калибровочной кривой для определения неизвестных NADH-концентраций. Методы для образования NAD(P)H из зависимой от NAD(P) дегидрогеназы, соответствующего субстрата и NAD(P) известны. Поэтому после соответствующей предварительной реакции NADH-носитель теста можно использовать для обнаружения субстратов дегидрогеназы или для обнаружения самих дегидрогеназ.

П р и м е р 5. Носитель теста для определения этанола при помощи спиртовой дегидрогеназы и диафоразы и 18-молибдодифосфата.

Получение носителя теста. Получают носитель теста по фиг. 6. Этот носитель теста получают таким образом, что готовят индикаторную систему из однородной суспензии, состоящей из 4 мл 0,2 цитратного буферного раствора, рН 6,0, 10 мл 10%-ного нонилсульфата натрия в воде, 60 мл татразина, 0,1 г N, N-бис-(2-оксиэтил)-р-нитрозоанилина х НСl, 6,8 мл 20%-ной 18-молибдодифосфорной кислоты в воде, 1 г 25%-ного тетраэтиламмонийхлорида в воде, 72 г 5% -ного коллидона 25 ("БВСФ", "Людвигсхафен", ФРГ) в 50 ммоль цитратного буферного раствора, рН 6,0, которым пропитывают впитывающую бумагу ("Lang faser", "Schoeller", "Germshach", ФРГ) и затем сушат в течение 30 мин при 40^оС. Ферменты помещают на отдельной бумаге ("Lang faser", "Schoeller", "Germsbach", ФРГ). Бумагу пропитывают раствором: 50 г 0,2 М фосфатного буферного раствора, рН 7,0, 48 г воды, 2 мл 10-ного нонилсульфата натрия в воде, 6 г диофоразы (15 ед./мг лиофилизата), 2 г спиртовой дегидрогеназы (250 ед./мг лиофилизата), и затем сушат при 40^оС в течение 20 мин. Полученную таким путем индикаторную бумагу 13 и ферментную бумагу 12 разрезают на ленты размером 14х6 мм. На полиэфирной пленке толщиной 350 мкм, длиной 9,8 см и шириной 0,6 см ("Мелинекс", "ICI", Франкфурт, ФРГ) закрепляют стекловолокнистый холст длиной 16 мм, шириной 6 мм и толщиной 0,25 мм с весом единицы поверхности 25 г/м², как холст 14 переноса, стекловолокнистый холст шириной 6 мм, длиной 6 мм и толщиной 700 мкм с весом единицы поверхности 60 г/м², как холст 15 для отделения эритроцитов и защитную сетку 16 из Serynel РЕ280НС красного R с размерами 6х8 мм и с размером отверстий 280 мкм, при помощи полосы 18 из плавкого клея (фиг. 6). Ферментную бумагу 12 и индикаторную бумагу 13 вместе с прозрачной поликарбонатной пленкой ("Покален", "Лонза", "Райнфельден", ФРГ) толщиной 200 мкм, длиной 15 мм и шириной 6 мм закрепляют при помощи капли 19 плавкого клея на пленке-носителе 17 таким образом, что слои 11, 12 и 13 не касаются, но благодаря давлению могут приводиться в жидкостный контакт как друг с другом, так и с находящейся в холсте переноса жидкостью.

Определение этанола. На полученный носитель теста по фиг. 3 наносят на защитную сетку 16 32 мл крови. Через 60 с давлением на прозрачную пленку 11, ферментную бумагу 12 и индикаторную бумагу 13 прижимают к холсту 14 переноса и к находящейся в нем сыворотке крови. Через 120 с измеряют ремиссию в процентах при 642 нм через прозрачную пленку 11. Но при применении известных различных концентраций этанола в крови получают кривую, изображенную на фиг. 7. Эта кривая может служить калибровочной кривой для определения неизвестной концентрации этанола в пробе.

П р и м е р 6. Определение β -галактозидазы (ЕС 3.2.1.23). Используют следующие растворы: буферный раствор: 0,1 М НЕРЕS, 20 ммоль хлористого магния, рН 6,8; субстрат: 50 ммоль р-аминофенил-β -галактозида (полученного из р-нитрофенил- β -D-галактозида с водородом на Рα-угле в воде; нейтрализатор: 1 н. натровый щелок; индикатор: 100 мг/мл 18-молибдодифосфорной кислоты и 50 мг/мл фенил-триметил-аммонийхлорида в воде; фермент: 180 ед./мл в буферном растворе (указанная активность фермента относится к применению о-нитрофенолгалактазида в качестве субстрата).

Для теста в реакционном сосуде смешивают, мл: буферный раствор 780; индикатор 100; нейтрализатор 20; субстрат 100; фермент: а) 0, б) 1, в) 5, г) 3, д) 4, е) 5.

После 0,5-1 мин инкубации центрифугируют 0,5 мин. Надосадочную жидкость сбрасывают, осадок растворяют в 1 мл диметилсульфоксида и сразу измеряют экстинкцию (табл. 3).

Получающуюся из этих величин калибровочную кривую можно применять для определения содержания β -галактозидазы в неизвестных пробах.

П р и м е р 7. Определение щелочной фосфатазы (ЕС 3.1.3.1). Если в рецептуре примера 6 в качестве субстрата применяют 50 ммоль р-аминофенилфосфата и в качестве буферного раствора 1 М диэтаноламин, 1 ммоль хлористого магния, 0,1 ммоль хлористого цинка, рН 9,8, то тем самым можно производить определение фермента щелочной фосфатазы. С известными концентрациями фермента, как в примере 6, находят линейную зависимость между концентрацией фермента и экстинкцией при 800 нм.

П р и м е р 8. Носитель теста для обнаружения γ-глютамилтрансферазы (ЕС 2.3.2.2). Аналогично примеру 1 получают носитель теста, но со следующими изменениями: во втором слое реактивов буферный раствор (2 мас. Келтрола F в 0,2 М цитратном буферном растворе, рН 6,0) заменяют 2 мас. Келтрола F в воде, N,N-бис-(2-оксиэтил)-р-нитрозоанилин х НСl и глюкозооксидазу опускают. Между переносимым клеем 2 и вторым слоем 3 реактивов (фиг. 1) вкладывают пропитанную субстратом бумагу, которую получают следующим образом.

Бумагу от мешочка с чаем (12 г/м²) пропитывают раствором 250 ммоль глицилглицина и 20 ммоль γ-L-глутамил-3-карбокси-1,4-фенилендиамина в 250 ммоль трис-буферного раствора, рН 7,6 и сушат 20 мин при 50^оС. В 0,1 М трис-буферного растворе с 10 мг/мл сывороточного альбумина крупного рогатого скота, рН 7,5 получают серию разбавлений γ -глутамилтрансферазы, 10 мл этого раствора подают на вышеописанный носитель теста. Через одну минуту измеряют при 37^оС приведенные в табл. 4 величины ремиссии при длине волны 950 нм.

Полученная таким путем кривая может использоваться для определения неизвестного содержания γ -глутамилтрансферазы в жидкостях.

П р и м е р 9. Носитель теста для обнаружения кислой фосфатозы (ЕС 3.1.3.2). Аналогично примеру 8 получают носитель теста для обнаружения кислой фосфатозы, если бумагу от мешочка с чаем пропитывают 10 ммоль р-аминофенилфосфата в 0,1 М цитратом буферном растворе, рН 5,0.

Формула изобретения

1. Способ определения электрононасыщенного ароматического амина, являющегося маркером содержания аналита в биологической жидкости, включающий контактирование жидкости со средством, приводящее к образованию гетерополисини, с последующим измерением ее содержания, отличающийся тем, что жидкость контактируют со средством, содержащим труднорастворимую соль гетерополикислоты, причем количество труднорастворимой соли гетерополикислоты в средстве достаточно для обращения всего образовавшегося при контактировании амина в гетерополисинь.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используется труднорастворимая соль гетерополикислоты молибдена, молибдена и вольфрама, ванадия и молибдена, или ванадия и молибдена и вольфрама с фосфором, мышьяком, кремнием или германием в качестве гетероатома.

3. Способ по одному из п. 2, отличающийся тем, что в качестве труднорастворимой соли гетерополикислоты используют такую, катион которой больше, чем ион аммония.

4. Способ по одному из п. 2 или 3, отличающийся тем, что в качестве труднорастворимой соли гетерополикислоты используют соль с катионом общей формулы I R¹ R² R³ R⁴ X⁺, где R¹, R², R³, R⁴ - одинаковые или различные остаток алкила, арила или алкиларила или водород, если не все остатки одинаковы, причем два остатка вместе являются остатком алкилена; X - фосфор или азот.

5. Способ по одному из пп. 2 - 4, отличающийся тем, что в качестве труднорастворимой соли гетерополикислоты используют соль с катионом из группы квартернированных азотных гетероароматических веществ.

6. Средство для определения электрононасыщенного ароматического амина, являющегося маркером содержания аналита в биологической жидкости, содержащее компонент для образования гетерополисини и соответствующие аналиту ингредиенты, отличающееся тем, что средство содержит труднорастворимую соль гетерополикислоты в количестве, достаточном для перевода всего амина в гетерополисинь.

7. Средство по п. 6, отличающееся тем, что оно содержит труднорастворимую соль гетерополикислоты молибдена, молибдена и вольфрама, ванадия и молибдена и вольфрама с фосфором, мышьяком, кремнием или германием в качестве гетероатома.

8. Средство по пп. 6 и 7, отличающееся тем, что в качестве труднорастворимой соли гетерополикислоты используют соль, катион которой больше, чем ион аммония.

9. Средство по одному из пп. 6 - 8, отличающееся тем, что в качестве труднорастворимой соли гетерополикислоты используют соль с катионом общей формулы II R¹ R² R³ R⁴ X⁺, где R¹, R², R³, R⁴ - одинаковые или различные остаток алкила, арила или алкиларида или водород, если не все остатки одинаковы, причем два остатка вместе являются остатками алкилена; X - фосфор или азот.

10. Средство по одному из пп. 6 - 9, отличающееся тем, что оно содержит в качестве труднорастворимой соли гетерополикислоты соль с катионом из группы квартернизованных гетероароматических соединений азота.

11. Средство по одному из пп. 6 - 10, отличающееся тем, что оно содержит труднорастворимую соль гетерополикислоты или необходимые для таковых вещества в жидкой среде или форме, связанной с носителем.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10