Антипротеиназный препарат

 

Изобретение относится к медицине, а именно к лечебным антипротеиназным препаратам, и может быть использовано для коррекции состояний, связанных с повышением протеолитической активности в тканях, крови и других биологических жидкостях. Изобретение позволяет создать антипротеиназный препарат на основе белкового ингибитора протеиназ, обладающий поливалентной антипротеиназной активностью по отношению к сериновым панкреатическим и лейкоцитарным протеиназам, способностью оказывать пролонгированное лечебное действие и не подавлять активность сериновых протеиназ калликреин - кининовой и свертывающей систем крови. Сущность изобретения состоит в том, что в качестве основного компанента антипротеиназного препарата используют овомукоид из белка утиных яиц. 2 табл.

Изобретение относится к медицине, а именно к лечебным антипротеиназным препаратам, и может быть использовано для коррекции состояний, связанных с повышением протеолитической активности в тканях, крови и других биологических жидкостях.

Многие тяжелые заболевания сопровождаются активацией процессов протеолиза. Ключевая роль в их запуске принадлежит лейкоцитарным сериновым протеиназам (эластаза, катепсин G), а также панкреатическим протеиназам (трипсин, химотрипсин, эластаза). В связи с этим одним из наиболее эффективных путей коррекции патологических состояний, связанных с гиперактивацией протеолитических ферментов, является селективное подавление их активности.

Известны используемые для этой цели препараты, получаемые из поджелудочной железы крупного рогатого скота -"Тразилол", "Контрикал", "Апротинин", "Тзалол", "Гордокс" и др. [1] Однако, проявляя высокий аффинитет к трипсину и химотрипсину, данные препараты малоэффективны по отношению к другим, наиболее агрессивным при патологии организма, сериновым протеиназам лейкоцитарной и панкреатической эластазе, лейкоцитарному катепсину G. К тому же, лечебное действие антиферментных препаратов, получаемых из поджелудочной железы, вследствие их низкой молекулярной массы и быстрого выведения из организма кратковременно.

Наиболее близким (прототип) к заявляемому по технической сущности и достигаемому эффекту является антипротеиназный препарат (Контрикал), содержащий белковый ингибитор протеиназ, натрия хлорид и воду для инъекций [2] В качестве ингибитора протеиназ этот препарат содержит основной панкреатический ингибитор трипсина при следующем соотношении компонентов, г/л: Основной панкре- атический ингиби- тор трипсина 8,0-15,0 Натрия хлорид 8,5-10,0 Вода для инъекций До 1,0 л Основной панкреатический ингибитор трипсина обладает высоким сродством к активированным ферментам поджелудочной железы трипсину и химотрипсину, в связи с чем наиболее эффективен при патологии этого органа.

Недостатками известного антипротеиназного препарата являются низкая активность по отношению к другим сериновым протеиназам, прежде всего лейкоцитарным (эластаза, катепсин G), высокая скорость выведения из организма (период полувыведения при внутривенном введении составляет 90 минут), а также способность подавлять активность сериновых протеиназ калликреин-кининовой и свертывающей систем крови, что может вызывать региональные нарушения микроциркуляции.

Задачей изобретения является создание антипротеиназного препарата на основе белкового ингибитора протеиназ, обладающего поливалентной антипротеиназной активностью по отношению к сериновым панкреатическим и лейкоцитарным протеиназам, способностью оказывать пролонгированное лечебное действие и не подавлять активность сериновых протеиназ калликреин-кининовой и свертывающей систем крови.

Достигается это тем, что антипротеиназный препарат, содержащий белковый ингибитор протеиназ, натрия хлорид и воду для инъекций, в качестве белкового ингибитора протеиназ содержит овомукоид из белка утиных яиц при следующем соотношении компонентов, г/л: Овомукоид из белка утиных яиц 0,5-50,0 Натрия хлорид 8,5-10,0 Вода для инъекций До 1,0 л Овомукоид из белка утиных яиц получают по методу, описанному [3] Состав готовят следующим образом.

П р и м е р 1. 10,0 г полученного в асептических условиях, очищенного ультрафильтрацией и лиофильно высушенного овомукоида из белка утиных яиц растворяют в воде для инъекций, добавляют 9,0 г апирогенного натрия хлорида и доводят объем раствора до 1,0 л водой для инъекций. Раствор фильтруют через стерилизующий фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Антипротеиназный препарат готов к употреблению.

П р и м е р ы 2-5. Антипротеиназный препарат готовят по примеру 1, используя 0,5 г овомукоида и 8,5 г натрия хлорида; 3,0 г овомукоида и 10,0 г натрия хлорида; 25,0 г овомукоида и 9,0 г натря хлорида; 50,0 г овомукоида и 9,0 г натрия хлорида, соответственно.

Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявляемый объект отличается химической природой белкового ингибитора протеиназ, то есть заявляемое решение соответствует критерию "новизна". Оно также соответствует критерию "изобретательский уровень", так как среди известных антипротеиназных препаратов отсутствуют вещества, обладающие поливалентной антипротеиназной активностью по отношению к сериновым панкреатическим (трипсин и химотрипсин) и лейкоцитарным (эластаза и катепсин G) протеиназам, а также способностью оказывать пролонгированное лечебное действие.

П р и м е р 6. В опытах на 92 крысах линии Вистар обоего пола весом 200,0 г изучают лечебный эффект антипротеиназного препарата на фоне острого деструктивного панкреатита. Моделирование воспаления поджелудочной железы осуществляют путем введения консервированной медицинской желчи в общий билиопанкреатический проток путем канюляции его через просвет двенадцатиперстной кишки тупой иглой 0,4 мм диаметром. Объем вводимой желчи 0,1 мл на 100 г массы тела. Животных разделяют на контрольную (48 особей) и две опытные серии: для изучения лечебной эффективности заявляемого объекта (22 особи) и препарата сравнения Контрикала (22 особи). Сравниваемые препараты вводят внутривенно однократно, через 2 часа после моделирования острого панкреатита в дозе 10 мг на кг массы тела. В контрольной серии никакого лечения не проводят.

В динамике развития заболевания осуществляют биохимическое исследование плазмы крови, оценивают показатель летальности животных, изучают морфо-структурные особенности течения патологического процесса в поджелудочной железе.

При выбранной модели панкреонекроза в ткани поджелудочной железы у крыс контрольной серии развивается картина крупноочагового прогрессирующего панкреонекроза с геморрагиями в некротизированных тканях, жировыми некрозами и нагноением. Происходит резкое увеличение протеолитической активности плазмы крови животных, достигающее максимума через 3-4 ч после начала эксперимента, при повторном, еще более выраженном подъеме спустя 1 сутки. Необходимо отметить четкую корреляцию биохимических и гистологических исследований на высоте развития геморрагического компонента некроза и появления стеатонекроза титр амидазной активности (БАПНА) плазмы крови является наивысшим (табл. 1). Прогрессирование патологического процесса в этой серии животных вызывает гибель части из них: летальность через 24 и 48 ч после начала эксперимента составляет 45,8% (22 особи) и 77,1% (37 особей) соответственно.

Гистологические исследования тканей поджелудочной железы в серии животных с внутривенным введением заявляемого антипротеиназного препарата показывают, что уже через 1 ч в поджелудочной железе регрессируют явления интерстициального отека, гемореологические нарушения, дистрофические и некробиотические изменения ацинарных клеток. В этот же период отмечается значительное, более чем в 30 раз по отношению к аналогичному периоду у животных контрольной серии, и более чем в 15 раз к исходным данным снижение суммарной протеолитической активности плазмы крови крыс. Через 4 и 22 ч после инъекции заявляемого антипротеиназного препарата его ингибирующее действие на амидазные системы крови сохраняется, причем уровень протеолитической активности в эти временные интервалы не превышает начальные величины.

По гистологическим данным через 22 часа после введения заявляемого объекта отсутствуют признаки прогрессирования некроза и гемореологических нарушений в системах макро- и микроциркуляторного русла. Вокруг очагов воспаления возникает четкая воспалительная демаркация. Снижение интерстициального отека, отсутствие дистрофических изменений ацинарных клеток в оставшихся жизнеспособных дольках приводит к восстановлению эксфузии зимогенов в просвет протоков, предотвращая тем самым парапедез их в интерстиций и поступление в кровеносные и лимфатические сосуды. Лечение заявляемым объектом тормозит прогрессирование дистрофических и некробиотических изменений ацинарных клеток и способствует, тем самым уменьшению масштабов поражения. Под влиянием проведенного лечения прекращается не только распространение гемореологических нарушений, но и восстанавливается, после лизиса или реканализации тромбов, кровоток в первично поврежденных артериях и венах. Большинство животных этой серии выживает. Летальность через 24 ч составляет 13,6% (3 особи), через 48-22,7% (5 особей) соответственно.

Во второй опытной серии экспериментов лечение панкреонекроза проводят внутривенным введением препарата сравнения Контрикала. По сравнению с крысами, леченными заявляемым объектом, через 1 ч после инфузии Контрикала отмечается более значительный уровень суммарной протеолитической активности плазмы крови (табл.1). Тем не менее введение препарата сравнения способствует существенному (р<0,05) снижению амидазной активности относительно сопоставимого срока в контроле. Гистологические различия между опытными сериями в этот временной интервал не проявляются. Однако спустя 4 ч после инъекции Контрикала протеолитическая активность плазмы достигает соответствующих значений в контрольной серии, более чем в 2 раза превышая таковую у животных с введением заявляемого объекта. Гистологически в этот период наблюдается картина обострения патологического процесса в поджелудочной железе с элементами повторных геморрагий, усугубление дистрофических и некробиотических изменений ацинарных клеток, увеличение зон с гемореологическими расстройствами. В дальнейшем через 22 ч после коррекции панкреонекроза инфузиями Контрикала уровень протеолитической активности еще более возрастает, статистически достоверно отличаясь не только от исходных значений, но и от показателей сравниваемой опытной группы (табл.1). Тем не менее анализ динамики изменений общей амидазной активности плазмы равно как и морфо-функциональных перестроек в паренхиме поджелудочной железы свидетельствует о том, что введение Контрикала также способствует торможению развития патологического процесса в органе, хотя выраженность этого лечебного эффекта значительно ниже в сравнении с заявляемым объектом, а способность ингибировать активные формы сериновых протеиназ краткосрочно, проявляется лишь в течение 1-2 ч после инфузии. Инъекции заявляемого объекта напротив способствуют стабильному удержанию уровня суммарной амидазной активности плазмы животных с экспериментальным панкреонекрозом в границах физиологической нормы практически в течение 22 ч после введения, обеспечивая тем самым мобилизацию компенсаторно-приспособительных репаративных и пролиферативных механизмов. Летальность при лечении Контрикалом через 24 ч составляет 22,7% (5 особей), через 48 54,5% (12 особей) соответственно.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой лечебной антипротеиназной активности заявляемого антипротеиназного препарата, его способности длительно (пролонгировано) ингибировать активные формы сериновых протеиназ, что можно отнести за счет особенностей химической структуры входящего в состав препарата овомукоида из белка утиных яиц.

П р и м е р 7. Для определения антипротеиназной активности заявляемого объекта, препарат, содержащий 9,0 г/л натрия хлорида и 10,0 г/л, овомукоида разводят 0,1 М трис-НСl буфером, рН 8,0, содержащем 0,02 М СаСl₂, до концентрации овомукоида 0,46х10^-9 моль в 1 мл, 0,5 мл полученного раствора (содержание овомукоида 0,23х10^-9 моль) добавляют к 0,5 мл раствора трипсина в том же буфере (содержание трипсина 0,46х10^-9 моль) и инкубируют в течение 5 мин при 37^оС. Для определения остаточной активности фермента к инкубационной смеси добавляют 3,5 мл раствора п-нитроанилида N,α-бензоил-D,L-аргинина (0,75х10^-3 М) в том же буфере. Реакцию останавливают через 10 минут добавлением 0,5 мл 30%-ного раствора уксусной кислоты и измеряют плотность раствора при 410 нм. Контрольный эксперимент проводят по аналогичной методике в отсутствии овомукоида. Остаточную активность фермента рассчитывают путем деления оптической плотности пробы на оптическую плотность контроля и выражают в процентах.

Результаты измерения приведены в табл.2.

П р и м е р ы 8-12. Эксперимент проводят по примеру 7, используя препараты, содержащие 0,5 г/л овомукоида и 8,5 г/л натрия хлорида; 3,0 г/л овомукоида и 10,0 г/л натрия хлорида; 25,0 г/л овомукоида и 9,0 г/л натрия хлорида; 50,0 г/л овомукоида и 9,0 г/л натрия хлорида; 0,9 г/л овомукоида и 9,0 г/л натрия хлорида соответственно.

П р и м е р ы 13-14. (Контроль, по прототипу). Эксперимент проводят по примеру 7, используя препарат Контрикал.

П р и м е р ы 15-24. Эксперимент проводят по примеру 7. Используемые ферменты, белковые ингибиторы протеиназ, субстраты для определения активности, а также результаты измерения активности приведены в табл.2.

Формула изобретения

АНТИПРОТЕИНАЗНЫЙ ПРЕПАРАТ на основе ингибитора протеиназ белковой природы, натрия хлорида и воды для инъекций, отличающийся тем, что в качестве ингибитора протеиназ он содержит овомукоид из белка утиных яиц при следующем соотношении компонентов, г/л: Овомукоид из белка утиных яиц - 0,5 - 50,0 Натрия хлорид - 8,5 - 10,0
Вода для инъекций - До 1 л

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2