Способ получения рекомбинантного человеческого свободного от метионина на n-конце гамма-интерферона

 

Использование: медицина, производство рекомбинантного человеческого несодержащего цистеина гамма-интерферона, свободного от метионина на N-конце, используемого для приготовления ценного терапевтического средства - гамма-интерферона. Сущность изобретения: способ осуществляется путем экспрессии плазмиды pIBM в штамме E. Coli Е 392, депонированном в Национальном Депозитарном Центре для промышленных микроорганизмов и клеточных культур под номером 845, и последующим культивированием его в ферментере при 36 - 38^oС в условиях аэрации, после чего продукт очищают, ренатурируют и элюируют с удалением сопутствующих растворителей и примесей.

Изобретение касается способа получения рекомбинантного, не содержащего цистеина, человеческого гамма-интерферона, свободного от метионина на N-конце, который может использоваться в медицине.

Известны способы получения рекомбинантного человеческого цистеин-содержащего гамма-интерферона и не содержащего цистеина гамма-интерферона с помощью его экспрессии в бактериальных клетках. По этим способам рекомбинантный интерферон содержит дополнительно метионин у его N-терминала, который остается как инициирующая аминокислота в бактериальном синтезе.

Известен способ получения не содержащего цистеина гамма-интерферона, свободного от метионина на его N-конце, который основан на секретоспособной экспрессиии в бактериальных клетках и на использовании альфа-амилазного промотора и сигнальной последовательности для секреции.

Недостатки известных способов получения рекомбинантного человеческого цистеин-содержащего, или не содержащего цистеин, гамма-интерферона, состоят в том, что они приводят к получению протеина, дополнительно содержащего метионин на N-конце, присутствие которого нежелательно, поскольку это делает продукт иммуногенным и его длительное введение в качестве терапевтического препарата может привести к образованию специфических антител.

Недостаток способа приготовления рекомбинантного, не содержащего цистеина, гамма-интерферона, свободного от метионина на его N-конце, заключается в том, что удаление этого метионина осуществляется секрецией в периплазматическом пространстве бактерий. Во время транспортировки существует опасность конформационных изменений, которые также могут привести к иммуногенности препарата. Другим недостатком является исключительно низкий выход интерферона 3 млн. ед. на 1 л культуры.

В отношении способа очистки известные способы основаны на иммуносорбции гамма-интерферона или на использовании других хроматографических сорбентов.

Недостатком иммуносорбции в качестве способа очистки гамма-интерферона является использование дорогостоящих, высокоспецифичных моноклональных антител, приготовление которых требует особой технологии, а также существует опасность загрязнения конечного продукта трансформирующими факторами и вирусами, происходящими от гибридомных линий. В результате могут возникать конформационные изменения гамма-интерферона (денатурация), что приводит к снижению его биологической активности.

Недостатком хроматографического способа без использования моноклональных антител является то, что поскольку этот способ основан на тиол-сефарозной хроматографии, то он применим только для цистеин- содержащего гамма-интерферона.

Гамма-интерферон, как и многие другие рекомбинантные протеины, может быть легко агрегирован в растворах, которые не содержат денатурирующие или хаотропные агенты. После удаления гуанидин-хлорида по некоторым из хорошо известных методов (ультрафильтрация, гель-фильтрация, диализ) гамма-интерферон агрегируют. В результате выход растворимого, биологически активного гамма-интерферона может изменяться как функция от температуры, начальной концентрации протеина, скорости обмена растворителя, присутствия моно- и бивалентных ионов, и, вероятно, от других, пока еще неизвестных факторов. Все это препятствует стандартизации технологии, снижает выход и повышает стоимость конечного продукта.

Цель изобретения обеспечить способ получения рекомбинантного человеческого, не содержащего цистеина, гамма-интерферона, свободного от метиона на его N-конце, который бы гарантировал высокий выход и высокую степень чистоты продукта, так же как и полное растворение в водных, биологически приемлемых растворах, не содержащих денатурирующих или хаотропных веществ.

Цель достигается способом получения рекомбинантного человеческого, не содержащего цистеин гамма-интерферона, свободного от метионина на N-конце посредством экспрессии искусственного гена гамма-интерферона в микроорганизмах рода E.coli, в частности, штамма E.coli депонированного в Национальном Банке депонирования промышленных микроорганизмов и клеточных культур под депозитарным номером 845, причем рекомбинантный штамм, содержащий экспрессивную плазмиду pIBМ, культивируется в питательной среде, содержащей обычно пептонную основу и дрожжевой экстракт в качестве источников азота, обогащенной L-триптофаном и L-метионином, и в присутствии тетрациклина. Параметры ферментации выбраны таким образом, что они обеспечивают быстрое проявление экспонентного роста, контролируемого в ходе процесса добавлением глюкозы. Прекращение аэроации в конце процесса благоприятствует удалению метионина на N-конце, также как и образованию тел включения, имеющих высокое процентное содержание интерферона в межклеточном пространстве бактерий. После экстракции рекомбинантный человеческий, не содержащий цистеина гамма-интерферон, подвергают дополнительной хроматографической обработке на колонне с карбоксиметилсефарозой, чтобы удалить растворитель, и ренатурации.

После получения интерферона необходимо для адсорбции и сохранения интерферона на ионообменнике, чтобы концентрация гуанидин-хлорида была ниже 0,35М, но не ниже 0,1 М. При более низкой концентрации гуанидин-хлорида интерферон агрегирует слишком быстро.

Чтобы получить хорошие результаты, экстракт, содержащий гамма-интерферон, разбавляют ледяным буфером с рН 5,0-8,5 и молярностью 0,005-0,1 М, пока не будет достигнута концентрация гуанидин-хлорида 0,7-1,0 М. Немедленно после зарядки колонны карбоксиметил-сефарозой, растворы гамма-интерферона и ледяного буфера смешивают так, чтобы разведение обеспечило для прохождения через колонну конечную концентрацию гуанидин-хлорида 0,35 М. Гуанидин-хлорид удаляют длительным промыванием колонны соответствующим буфером. Гамма-интерферон элюируют градиентом хлорида натрия от 0,1 до 0,6 М в соответствующем буфере.

Продукт разводят апирогенной водой до физиологической концентрации натрия хлорида и смешивают с 10%-ным раствором декстрана до конечной концентрации 2% с использованием его в качестве стабилизатора (5).

Преимущество способа согласно изобретению заключается в том, что получают гамма-интерферон, метионин которого в N-терминала был удален внутриклеточно, а не путем секреции, так что выход гамма-интерферона очень высок и превышает 1 млрд.ед на литр культуры, что чистота полученного рекомбинантного человеческого не содержащего цистеина гамма-интерферона составляет более 99,6% что он сохраняет всю свою биологическую активность, после лиофилизации в присутствии подходящего стабилизатора, и растворим в водных растворах, не содержащих денатурирующих или хаотропных агентов, и, кроме того, технология избегает применения моноклональных антител для очистки рекомбинантного протеина, что могло бы загрязнить продукт, что используют недорогие технические средства для хроматографии, которые широко применяются на практике, и что теперь имеется возможность автоматизированного широкомасштабного производства с использованием ионообменника, который может быть регенерирован и стерилизован при многократном промышленном использовании.

П р и м е р. Штамм-продукт LE 392 E.coli, носитель рекомбинантной плазмиды pIBМ, сохраняют при -70^оС в культуре с 15% глицерина. После контроля чистоты и активности материал для посева культивируют в течение 7 ч при 37^оС и встряхивании в питательной среде, идентичной ферментативной среде, в объеме 10% рабочего объема ферменте, а ферментацию осуществляют в стандартном бактериологическом ферментере, снабженном перемешивающим устройством и имеющей рабочий объем 4 л, в питательной серде со следующим составом: Измельченный (тритури- рованием) пептон 25 г Дрожжевой экстракт 5 г Хлорид натрия 5 г Na₂HPO₄ 6 г K₂HPO₄ 3 г (NH₄)₂SO₄ 3 г MgSO₄-1M 2 мл CaCl₂ 100 мМ 100 мл
Глюкоза 20% 50 мл
L-триптофан 20 мкг/мл 5 мл
L-метионин 20 мкг/мл 5 мл
Тетрациклин 10 мкг/мл 1,2 мл
Ферментацию начинают при начальном рН 7,1-7,2 и начальном объеме аэрации 0,5 л/1л/мин, температуре 37,2^оС и 400 об/мин перемешивающего устройства.

Когда культура достигает экспоненциальной фазы роста, объем аэрации увеличивают до 1л/1л/мин. На шестом часу от начала ферментации в культуру добавляют 40 мл 20% глюкозы, и после окончания экспоненциального роста, аэрацию прерывают, и культуру перемешивают еще в течение часа с 400 об./мин.

Культуральную жидкость охлаждают и собирают биомассу. Выход составляет приблизительно 20 г клеточной массы (литр культуры). Биомассу разделяют и экстрагируют гамма-интерферон из частиц белка, а затем частично очищают фракционной преципитацией.

Полученный раствор гамма-интерферона разбавляют при перемешивании ледяным раствором 0,05 М ацетата натрия при рН 6,0 до концентрации гуанидин-хлорида 0,7 М. Приготовленный таким образом раствор загружают в колонну с карбоксиметил-сефарозой ("Фармация", 2,6х10 см, уравновешена 0,05 М ацетат-натриевым буфером с рН 6,0), причем немедленно перед адсорбцией посредством насоса и мешалки раствор гамма-интерферона разбавляют ледяным буфером до концентрации гуанидин-хлорида 0,35 М. Загрузку осуществляют со скоростью 1100 мл/ч. Колонну промывают 3-4 объемами буфера со включением 20-минутного градиента 2х60 мл 0,1-0,6 М хлорида натрия в 0,05 ацетат-натриевом буфере с рН 6,0 со скоростью элюирования 2 мл/мин. Гамма-интерферон элюируют при концентрации хлорида натрия 0,40-0,44 М. Выход чистого гамма-интерферона составляет почти 1 мг чистого протеина на 1 г бактериальной массы.

Определение степени чистоты полученного гамма-интерферона осуществляют двумя независимыми путями:
электрофорезом в присутствии натрий-додецил-сульфата и последующей денсиметрией плос, и хроматографией при высоком давлении на колонне Pro-RPC ("Фармация", Швеция, 5х20 мм). Градиент 20 мин 0,01% трифторуксусная кислота 100% ацетонитрил в 0,01% трифторуксусной кислоте и адсорбция при 280 нм чистота продукта 99,9% при использовании электрофореза и свыше 99,9% с использованием аналитической хроматографии.

Определение аминокислоты у N-терминала полученного рекомбинантного не содержащего цистеина гамма-интерферона осуществляют мечением аминокислоты у N-терминала. В качестве аминокислоты у N-терминала полученного человеческого не содержащего цистеина гамма-интерферона обнаружен глютамин. Присутствие метионина или других аминокислот не установлено.

Определение соотношения растворимый/агрегированный интерферон проводят центрифугированием раствора интерферона при 25 000 об/мин. Осадок (нерастворимый интерферон) отделяют. Растворимый интерферон в супернатанте осаждают 20% трихлоруксусной кислотой. После центрифугирования в течение 30 мин при 10 000 об/мин осадок растворяют в буфере для электрофореза и анализируют на полиакриламидном геле в присутствии найтрийдодецил-сульфата параллельно с осадком нерастворимого интерферона. После окрашивания геля количество протеина в полосах определяют денсиметрией.

Денсиметрическое определение показывает, что весь протеин (100%) находится в растворимом состоянии.

Концентрацию гамма-интерферона в растворе определяют и независимо с использованием молярного коэффициента затухания Е₂₈₀ 11 700.

Определение биологической активности осуществляют на основе защитного действия интерферона в отношении цитопатического действия вируса везикулярного стоматита на человеческой клеточной линии WISH. Анализ проводят на титровальных чашечках при понижающейся концентрации интерферона. В качестве единицы активности взята концентрация интерферона, при которой наблюдается 50% -ная защита клеток. Применяется лабораторный стандарт, калиброванный согласно международному стандарту.

В случаях, когда исследуют активность лиофилизированных препаратов, содержимое ампул восстанавливают 1 мл апирогенной воды через различные периоды времени (от 7 до 3 мес) после лиофилизации.

Препараты интерферона, исследованные таким образом, показали специфическую активность, равную примерно 5х10⁷ ед/мг.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ЧЕЛОВЕЧЕСКОГО СВОБОДНОГО ОТ МЕТИОНИНА НА N-КОНЦЕ ГАММА-ИНТЕРФЕРОНА, предусматривающий экспрессию безцистеинового гамма-интерферона в штаммах E. coli, трансформированных рекомбинантной плазмидой ДНК РМВ, содержащей синтетический ген, кодирующий гамма-интерферон, при культивировании в условиях аэрации с последующей очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что интерферон экспрессируют в штамм E. coli, депонированном в Национальное банке промышленных микроорганизмов клеточных культур под N 845, аэрацию увеличивают при вступлении бактерий в экспотенциальную фазу роста не позднее чем за 1 ч до отделения биомассы, а очистку проводят путем адсорбции на твердофазной подложке из карбоксиметилсефарозы в растворе 0,1 - 0,35 М гуанидинхлорида с последующим элюированием 0,4 - 0,55 М раствором NaCl.