Способ определения байлетона в биологическом материале

 

Использование: в медицине, биологии, токсикологической химии, для определения байлетона в биологическом материале. Сущность изобретения: биологический материал измельчают, многократно обрабатывают ацетоном, экстракт хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ-гексан-пропанол-2, затем хлороформом извлекают пятно с P_t=0,45, удаляют хлороформ, остаток обрабатывают 10%=ным раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте, смесь разбавляют водой, экстрагируют хлороформом, продукты экстракции повторно хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе хлороформ-ацетон-этил-ацетат. 2 табл.

Изобретение относится к биологии и токсикологической химии, а именно к способам определения байлетона в биологическом материале, и может быть использовано в практике химико-токсикологического и санитарно-гигиенического анализа. Способ относится к числу массовых.

Известен способ определения органических веществ в биологическом материале, заключающийся в измельчении биологического объекта, обработке водным раствором гидроксида натрия, центрифугировании, обработке центрифугата вольфраматом натрия в кислой среде при кипячении на водяной бане, отделении осадка центрифугированием в течение часа, экстракционном выделении анализируемых соединений из центрифугата эфиром с последующим подщелачиванием центрифугата и повторной экстракцией эфиром.

Способ малоселективен, отличается низкой степенью извлечения байлетона.

Известен способ определения органических соединений в биологическом материале путем измельчения объекта, двукратного настаивания с подкисленной до рН 2-2,5 водой (в течение 2 и 1 ч), объединения извлечений с последующей экстракцией анализируемых веществ сначала из кислой, а затем из щелочной среды органическим растворителем.

Способ недостаточно селективен по отношению к байлетону и характеризуется низкой степенью извлечения вещества.

Наиболее близким к изобретению по техническому решению и достигаемым результатам является способ определения органических веществ в биологическом материале путем измельчения исследуемого биологического объекта, неоднократного настаивания с этанолом (каждый раз в течение суток), объединении вытяжек, сгущения объединенного извлечения, осаждения в нем белков абсолютным этанолом, фильтрования, упаривания фильтрата до густоты сиропа и разбавления его водой с последующей экстракцией анализируемых соединений сначала из кислого, а затем из щелочного растворов.

Способ трудоемок, требует значительных затрат времени на его осуществление (несколько суток), характеризуется низкой степенью извлечения байлетона (не более 24% от первоначально внесенного количества). Данный способ не позволяет селективно определять байлетон в биологическом материале в присутствии целого ряда органических веществ различного строения.

Цель изобретения повышение чувствительности и селективности способа, сокращение продолжительности определения.

Цель достигается с помощью предлагаемого способа, который заключается в том, что биологическую ткань (например, ткань печени) измельчают, неоднократно обрабатывают ацетоном, ацетоновое извлечение хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ-гексан-пропанол-2 (15:15: 2), пятно с Rf 0,45 извлекают из сорбента хлороформом, хлороформ испаряют, остаток обрабатывают 10%-ным раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте, реакционную смесь разбавляют водой, экстрагируют хлороформом, продукты экстракции хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ-ацетон-этилацетат (8:7:3).

Сопоставительный анализ предлагаемого решения и прототипа показывает, что предлагаемый способ отличается от известного тем, что в качестве органического растворителя используют ацетон, а после отделения ацетоновое извлечение хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ-гексан-пропанол-2 (15:15:2), пятно с Rf 0,45 извлекают из сорбента хлороформом, хлороформ испаряют, остаток обрабатывают 10%-ным раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте, реакционную смесь разбавляют водой, экстрагируют хлороформом, а продукты экстракции хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ-ацетон-этилацетат (8:7:3), т.е. предлагаемое решение соответствует критерию "новизна".

Сравнение предлагаемого решения не только с прототипом, но и с другими техническими решениями в данной области техники не позволило выявить в них признаки, отличающие предлагаемое от прототипа, что позволяет сделать вывод о соответствии предлагаемого технического решения критерию "существенные отличия".

Способ осуществляется следующим образом.

Биологическую ткань, содержащую байлетон, измельчают, трижды настаивают с ацетоном (каждый раз в течение получаса), ацетоновые извлечения объединяют, растворитель испаряют, сухой остаток растворяют в ацетоне, часть ацетонового раствора хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ-гексан-пропанол-2 (15:15:2), пятно с Rf 0,45 извлекают из сорбента хлороформом, хлороформ испаряют, остаток обрабатывают 10%-ным раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте, реакционную смесь разбавляют водой, экстрагируют хлороформом, продукты экстракции хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ-ацетон-этилацетат (8:7:3).

Способ иллюстрируется следующим примером.

П р и м е р. Определение байлетона (3,3-диметил-1-(1Н-1,2,4- триазолил-1)-1(4-хлорофенокси)-бутанона-2) в ткани печени. К 50 г мелкоизмельченной ткани свежей трупной печени человека прибавляют 50 мг байлетона, тщательно перемешивают биологическую ткань с веществом и оставляют на сутки при 18-20^оС. По истечении этого времени смесь заливают 100 мл ацетона и выдерживают полчаса, периодически перемешивая. Извлечение отделяют и операцию настаивания повторяют еще дважды. Ацетоновые вытяжки объединяют, испаряют в токе воздуха при комнатной температуре до сухого остатка. Остаток растворяют в 25 мл ацетона. 0,5 мл ацетонового раствора наносят на хроматографическую пластину типа "Силуфол" UV-254 и хроматографируют в системе растворителей хлороформ-гексан-пропанол-2 (15: 15: 2). Байлетон проявляется в УФ-свете в виде темного пятна с Rf 0,45. Пятно байлетона вырезают из пластины вместе с подложкой, помещают в пробирку и дважды обрабатывают порциями хлороформа по 5 мл каждая. Хлороформные извлечения объединяют в выпарительной чашке и испаряют растворитель до сухого остатка. Остаток обрабатывают 1 мл 10% раствора нитрата калия в концентрированной серной кислоте. Через 8 минут после прибавления реактива в реакционную смесь вносят 4 мл воды. Полученный водный раствор экстрагируют хлороформом дважды по 10 мл. Объединенный хлороформный экстракт испаряют до получения сухого остатка. Остаток растворяют в незначительном количестве ацетона и количественно наносят на линию старта хроматографической пластины типа "Силуфол" UV-254. Хроматографируют в системе растворителей хлороформ-ацетон-этилацетат (8:7:3). Продукты нитрования байлетона проявляются на хроматограммах в виде желтых пятен с Rf 0,33 и 0,92. Желтая окраска пятен усиливается при обработке парами аммиака.

Для определения количества извлеченного из биологического материала байлетона и степени извлечения участки хроматографической пластины с пятнами веществ вырезают и помещают в одну пробирку, после чего обрабатывают 5 мл диметилформамида и фильтруют образующийся окрашенный раствор в спектрофотометрическую кювету. Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 472 нм. Измерения проводят на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. Количественное содержание байлетона определяют по уравнению калибровочного графика и пересчитывают на навеску вещества, внесенную в биологический материал.

Построение калибровочного графика. На линию старта хроматографической пластины типа "Силуфол" UV-254 наносят 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7 и 0,8 мл 0,1% -ного раствора байлетона (3,3-диметил-1-(1Н-1,2,4-триазолил-1) -1(4-хлорофенокси)-бутанона-2) в ацетоне и осуществляют хроматографирование в системе растворителей хлороформ-гексан-пропанол-2 (15:15:2). Байлетон обнаруживается на хроматограмме при облучении УФ-светом в виде темных пятен с Rf 0,45. Участки пластины с находящимися на них пятнами вещества вырезают и элюируют каждое пятно дважды порциями хлороформа по 5 мл каждая. Хлороформные извлечения объединяют в выпарительной чашке и испаряют растворитель до сухого остатка. Остаток обрабатывают 1 мл 10% раствора нитрата калия в концентрированной серной кислоте. Через 8 минут после прибавления реактива в реакционную смесь вносят 4 мл воды. Полученный раствор экстрагируют хлороформом дважды по 10 мл. Объединенный хлороформный экстракт испаряют до получения сухого остатка. Остаток растворяют в незначительном количестве ацетона и количественно наносят на линию старта хроматографической пластины "Силуфол" UV-254. Хроматографируют в системе растворителей хлороформ-ацетон-этилацетат (8: 7: 3). Желтые пятна продуктов нитрования байлетона с Rf 0,33 и 0,92 (для каждой из заданных концентраций) вырезают из хроматограммы, помещают в пробирку и обрабатывают диметилформамидом (5 мл) в течение 5 мин. Образующийся окрашенный раствор фильтруют непосредственно в спектрофотометрическую кювету через бумажный фильтр. Оптическую плотность раствора измеряют на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 472 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм на фоне раствора, полученного в контрольном опыте. По результатам измерений строят график зависимости оптической плотности растворов от концентрации определяемого вещества. Методом наименьших квадратов рассчитывают уравнение калибровочного графика, которое в данном случае имеет вид D 0,002661˙ C + 0,00655, где D оптическая плотность, C концентрация байлетона в 1 мл фотометрируемого раствора в мкг/мл.

Результаты определения байлетона в ткани печени приведены в табл. 1.

Предлагаемый способ по сравнению с прототипом повышает степень извлечения байлетона из ткани печени в 2,5 раза и чувствительность определения в 5 раз. Предлагаемый способ в отличие от прототипа более селективен и позволяет определять байлетон в присутствии различных классов органических соединений: производных алкилдинитрофенольного ряда (2-метил-4,6-динитрофенола, 2-фтор-октил-4,6-динитрофенола, 4-фтор-октил-2,6-динитрофенола), пиразола (1-фенил-2,3-диметил-4-метиламинопиразолон-5- N-метансульфата натрия, 1-фенил-2,3-диметил-4-диметиламинопиразолона-5), ксантина (1,3,7-триметилксантина, 3,7-диметилксантина, 1,3-диметилксантина), тропана (тропинового эфира d,l-троповой кислоты, скопинового эфира l-троповой кислоты), пиперидина (1,2,5-триметил-4-пропионилокси-4-фенилпиперидина), хинуклидина (3-ацетоксихинуклидина, 3-бензоилоксихинуклидина), хинолина (β-диэтиламиноэтиламида 2-бутоксицинхониновой кислоты, 4-(1'-метил-4'- диэтиламинобутиламино) -7-хлорхинолина, 2-(4'-нитростирил)-4-(1'-метил -4'-диэтиламинобутиламино) -6-метоксихинолина, 6'-метоксихинолил-(4')-[5-винилхинуклидил -(2)]-карбинола), феонетиазина (2-хлор-10-(3'-диметиламинопропил)- фенотиазина, 10-(3'-диметиламинопропил)-фенотиазина, 10-(2'-диметиламинопропил)-фенотиазина), хинолизидина ( α-спартеина), пирролизидина (платифиллина), изохинолина (6,7-диметокси-1-(3', 4'-диметоксибензил) изохинолина), фенантренизохинолина (морфина, кодеина), имидазола (пилокарпина).

Сравнительная характеристика предлагаемого и известного способов представлена в табл. 2.

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАЙЛЕТОНА В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ путем измельчения биологического объекта, обработки органическим растворителем и отделения полученного извлечения, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя используют ацетон, а после отделения ацетонового извлечения хроматографируют его в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ-гексан-пропанол-2(15 15 2), пятно в P_t 0,45 извлекают из сорбента хлороформом, хлороформ испаряют, остаток обрабатывают 10%-ным раствором нитрата калия в концентрированной серной кислоте, смесь разбавляют водой, экстрагируют хлороформом, а продукты экстракции хроматографируют в тонком слое силикагеля в системе растворителей хлороформ ацетон этилацетат (8 7 3).

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2