Способ определения активации свертывания плазмы крови фрагментами клеточных мембран

 

Использование : в медицине, в частности к лабораторной диагностике нарушений свертывания крови. Техническим результатом заявляемого способа является повышение точности способа определения МАСК. Сущность изобретения: определяют время рекальцификации в смеси исследуемого образца с субстратной плазмой, при этом время рекальцификации определяют в субстратной плазме, содержащей мембраны клеток исследуемого образца, а свертывающая активность мембран оценивается по калибровочной кривой, построенной по зависимости времени рекальцификации субстратной плазмы от свертывающей активности мембран. 2 ил., 1 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к исследованию крови, и может быть использовано для лабораторной диагностики нарушений свертываемости крови.

В крови, как известно, циркулируют модифицированные фрагменты клеточных мембран, обладающие, в отличие от поврежденных мембран клеток, коагулирующей активностью. Эта фоновая активность определяется в физиологических условиях. По современным представлениям многие виды нарушения свертываемости крови (ДВС-синдром, тромбозы, эмболии и др.) сопровождаются избыточным накоплением в кровотоке коагуляционно активных фрагментов клеточных мембран, запускающих свертывание крови как по внешнему, так и по внутреннему механизмам. Поиск надежных методов определения мембранной активации свертывания крови позволил бы создать базу для получения новых данных о патогенезе коагулопатий, новых критериев лабораторной диагностики и контроля за лечением указанных заболеваний.

Известные способы определения мембранной активации свертывания крови (МАСК) имеют низкую точность и мало пригодны для практических целей. В связи с этим разработка способа определения МАСК является важной научно-практической задачей коагулологии.

Известен способ определения циркулирующих в плазме мембран клеток путем определения активности специфического маркера 5'-нуклеотидазы. Изменение содержания этого фермента указывает на возможную роль фрагментов мембран в развитии гиперкоагуляционного состояния. Основным недостатком способа является односторонняя оценка количества мембран (в эквиваленте 5'-нуклеотидазы) без учета их коагуляционной активности.

Этот недостаток в значительной мере устранен в наиболее близком по техническому решению способе определения активности тромбопластина плазмы крови. Необходимо отметить, что под термином "тромбопластин" подразумеваются коагуляционно-активные мембраны клеток.

Способ-прототип заключается в следующем. Получают смесь бедной тромбоцитами плазмы от 5 здоровых доноров. Смесь центрифугируют с ускорением 52000 g в течение 60 мин, в результате получают субстратную плазму, освобожденную от мембран клеток. Приготавливают образцы бедной тромбоцитами плазмы исследуемого и здорового донора. Определяют время свертывания (рекальцификации) в смеси равных объемов субстратной и донорской бедной тромбоцитами плазмы (Т₁). Вслед за этим определяют время свертывания (рекальцификации) смеси равных объемов субстратной и исследуемой тромбоцитами плазмы (Т₂). Гемокоагулирующую активность циркулирующих в плазме крови мембран клеток определяют по формуле А 100 (%) Недостатком способа-прототипа является то, что при оценке результатов не учитывается исходный (обусловленный плазменными факторами свертывания) коагуляционный потенциал исследуемой плазмы, который варьирует на практике у больных в широком диапазоне. Это приводит к ошибке измерения МАСК. Влияние коагуляционного потенциала плазмы крови на результаты определения МАСК (%) при нормальной (100%) коагуляционной активности мембран представлено в таблице.

Как видно из таблицы, если при нормальной плазменной коагуляции показатели МАСК по сравниваемым методам практически не различались, то при исследовании образцов плазмы крови больных с гиперкоагуляцией, способ-прототип ложно занижал результаты, в среднем на 36% (p < 0,001).

При исследовании плазмы крови с гипокоагуляцией (например, у больных гемофилией или в гипокоагуляционной фазе ДВС-синдрома), результаты определения МАСК, напротив, ложно завышались, в среднем на 66% (p < 0,001). Таким образом, ошибка способа-прототипа составляет от 36% (при гиперкоагуляции) до 66% (при гипокоагуляции).

Техническим результатом изобретения является повышение точности определения мембранной активации свертывания плазмы крови (МАСК) путем определения времени рекальцификации в субстратной плазме, содержащей мембраны исследуемого образца, а их свертывающая активность оценивается по калибровочной кривой, построенной по зависимости времени рекальцификации субстратной плазмы от свертывающей активности мембран.

Если мембраны исследуемого образца плазмы осадить ультрацентрифугированием или на фильтре с определенным диаметром пор (0,2-0,4 мкм) (диаметр пор фильтра обусловлен размерами (более 0,04 мкм) мембран, обладающих коагуляционной активностью), появляется возможность отмыть их от плазмы на фильтре и ввести в состав стандартной субстратной плазмы, лишенной аутологичных мембран. Таким образом, время рекальцификации субстратной плазмы будет зависеть от активности введенных в нее мембран. Калибровочная кривая зависимости времени рекальцификации субстратной плазмы от количества внесенных в нее коагуляционно-активных мембран позволяет оценить по заявляемому способу активность мембран исследованного образца плазмы крови. Этим исключается влияние коагуляционного потенциала исследуемого образца плазмы на результаты определения МАСК (см. таблицу).

На фиг. 1 изображена схема фильтрующего устройства и этапы его использования; на фиг.2 калибровочный график для определения мембранной активации свертываний крови (МАСК).

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

Реактивы и оборудование: Лимоннокислый натрий, трехзамещенный, 3,8%-ный раствор; хлористый кальций, 0,025 М раствор; суспензия каолина, готовится из расчета 5,0 мг каолина в 1 мл мединал-HCl буфера (рН 7,4); плазма донорская, стандарт, лиофилизированная (используется для производства субстратной плазмы) производства Кировского НИИГиПК; мембранные капроновые микропористые фильтры (ТУ 15-16-3-85) производства фирмы "Хийу Калур" (Эстония) с размером пор 0,2 мкм. Допускается применение фильтров с аналогичным размером пор фирмы Nucleopore, Millipore; компрессор для создания избыточного давления воздуха от 0 до 2,0 кгс/см², например, "Установка УК 25-1,6М"; центрифуга;
фильтрующее устройство, позволяющее производить фильтрацию в прямом и обратном направлении (см. фиг.1).

Подготовка субстратной и исследуемой плазмы крови.

1. Приготовление субстратной плазмы.

В день исследования лиофилизированная плазма производства Кировского НИИГиПК разводится дистиллированной водой до ее объема, предшествующего сушке. Для проведения исследований необходимо 3-10 мл субстратной плазмы. Необходимо отметить, что аутологичные мембраны субстратной плазмы на этом этапе включены в ее состав, но они отбрасываются в ходе работы с фильтрующим устройством (см. ход определения);
2. Приготовление исследуемого образца плазмы.

Силиконированной иглой из вены набирают кровь в пробирку, содержащую 3,8% -ный лимоннокислый натрий. Кровь смешивают с антикоагулянтом в соотношении 9: 1 (9 мл крови и 1 мл антикоагулянта) и центрифугируют при 1500 об/мин (180 g) в течение 5 мин. Полученную при этом богатую тромбоцитами плазму переносят в другую пробирку и повторно центрифугируют при 3000 об/мин (700 g) в течение 20 мин. В результате получают бедную тромбоцитами плазму, которую используют для проведения анализа.

Ход определения.

В секцию А устройства для фильтрации плазмы (фиг.1, этап 1) вносят 1,0 мл исследуемой плазмы и под давлением 0,8-1,0 кг/см² фильтруют ее. Профильтрованную плазму отбрасывают. Для отмывки осажденных на фильтре мембран от остатков плазмы в этом же (прямом) направлении и под тем же давлением пропускают 1,0 мл мединалового буфера. Далее (фиг.1, этап 2) через фильтрующее устройство в обратном направлении пропускают под давлением субстратную плазму в объеме 1,0 мл, собирают ее в пробирку и используют для исследования (определения времени рекальцификации).

В результате этой операции осажденные на фильтре и отмытые от остатков исследуемой плазмы мембраны изучаемого образца переносятся в субстратную плазму, а аутологичные мембраны субстратной плазмы остаются на фильтре.

Время рекальцификации субстратной плазмы выполняется со стандартизацией по контакту фактора XIII каолином (см. Клинико-лабораторные методы в гематологии. Под ред. В.Г. Михайлова и Г.А. Алексеева. Ташкент, Медицина. 1986). Для этого 0,1 мл субстратной плазмы, взятой в пробирку, смешивают с 0,1 мл суспензии каолина. Пробирку помещают на водяную баню (37^оС) и через 3 мин к указанной смеси добавляют 0,1 мл раствора хлорида кальция, тотчас включают секундомер и отмечают время свертывания в секундах (до момента появления нитей фибрина). По калибровочной кривой (фиг.2), зная время рекальцификации субстратной плазмы, находят МАСК исследуемого образца плазмы (%).

Построение калибровочной кривой.

Приготавливают смесь равных объемов бедной тромбоцитами плазмы от 5 здоровых доноров. Содержание (свертывающая активность) мембран в этой смеси плазмы принимается за 100% Затем, варьируя при фильтрации в прямом и обратном направлении объемом исследуемой (донорской) плазмы при одинаковом объеме (1,0 мл) субстратной плазмы, получают образцы субстратной плазмы с различным содержанием (активностью) мембран. Так, при фильтрации в ходе этапа 1 (фиг. 1) 0,25 мл, 0,5 мл, 1,0 мл, 2,0 мл и 4,0 мл исследуемой донорской плазмы и смыве мембран, полученных от этих объемов плазмы, 1 мл субстратной плазмы (этап 2), подготавливают образцы субстратной плазмы, имеющие активность мембран соответственно 25, 50, 100, 200 и 400% Определение времени рекальцификации в перечисленных образцах позволяет построить кривую взаимозависимости этих показателей.

Пример построения такой кривой в логарифмических координатах представлен на фиг. 2 (использована донорская стандарт-плазма Кировского НИИГиПК, серия 030492).

Необходимо отметить, что достаточным является однократное построение калибровочного графика при работе с одной и той же партией лиофильно высушенной стандарт-плазмы на протяжении срока ее годности.

Методика приготовления плазмы с различным коагуляционным потенциалом, имеющей нормальную (100%) свертывающую активность мембран.

1. Приготавливают несколько образцов бедной тромбоцитами плазмы здоровых доноров и больных. Каждый образец помещают в устройство для фильтрации и пропускают под давлением через фильтр в прямом направлении в соответствии с этапом 1 (фиг.1), добиваясь при этом удаления аутологичных мембран. В профильтрованных образцах определяют время рекальцификации и отбирают пробы, результат анализа которых составляет 180-195 с (нормокоагуляция у здоровых доноров), менее 165 с (гиперкоагуляционный сдвиг) и более 210 с (гипокоагуляционный сдвиг).

2. Приготавливают смесь равных объемов бедной тромбоцитами плазмы от 5 здоровых доноров. Содержание (свертывающая активность) мембран в этой смеси принимается за 100% Смесь в объеме 1,0 мл помещают в устройство для фильтрации и пропускают под давлением через чистый фильтр в прямом направлении (фиг.1, этап 1). Профильтрованную плазму отбрасывают, а фильтр (после промывки пропусканием через него 1,0 мл мединалового буфера) используют как источник 100% активности мембран для заданного объема плазмы 1,0 мл. Для введения полученных мембран в плазму с различным коагуляционным потенциалом предварительно фильтрованные образцы плазмы с гипер-, гипо- и нормокоагуляцией (в объеме 1,0 мл) пропускают под давлением через фильтрующее устройство в обратном направлении (фиг.1, этап 2). В результате получают образцы плазмы с гипер-, гипо- и нормокоагуляционным потенциалом и нормальной (100%) во всех случаях свертывающей активностью мембран (см. таблицу).

У здоровых доноров МАСК по заявляемому способу колеблется в интервале от 86 до 112% в среднем 99,5±4,8% У больных с патологией системы гемостаза МАСК повышается (при тромбозах и ДВС-синдромах) или, наоборот, снижается (при гемофилии, первичном антифосфолипидном синдроме и др.) по сравнению с нормой.

П р и м е р 1. Больная Н. 27 лет. Диагноз: беременность 38 недель, преждевременная отслойка плаценты, ДВС-синдром. Мембранная активация свертывания плазмы крови составила 270%
П р и м е р 2. Больной Г. 68 лет. Диагноз: состояние после операции по поводу аденомы предстательной железы. Мембранная активация свертывания плазмы крови составила 185%
П р и м е р 3. Больная Т. 19 лет. Диагноз: беременность 8 недель, первичный антифосфолипидный синдром. Мембранная активность свертывания плазмы крови составила 16%
Определение МАСК с помощью заявляемого способа, как и с помощью известного прототипа, ведется по оценке коагуляционного действия мембран исследуемого образца на субстратную, лишенную аутологичных мембран плазму. Вместе с тем, заявляемый способ определения МАСК за счет очистки мембран исследуемого образца от примеси плазмы позволяет повысить точность способа (см. таблицу) на 36% (при гиперкоагуляции) и 66% (при гипокоагуляции), что достигается исключением влияния коагуляционного потенциала примеси плазмы исследуемого образца.

Кроме того, необходимо отметить, что оптимальной процедурой для получения субстратной плазмы, очищенной от аутологичных мембран, является процедура фильтрации в сравнении с ультрацентрифугированием, так как последнее требует сложного оборудования и дополнительного помещения, а затраты времени на получение субстратной плазмы составляют соответственно 3-5 мин и 1,5-2 ч.

Предлагаемый способ прост, подвергается стандартизации (за счет использования референтной лиофильно высушенной плазмы здоровых доноров), выполняется за короткий промежуток времени (10-15 мин) и может использоваться в лабораториях научных и практических лечебных учреждений различного типа.

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВАЦИИ СВЕРТЫВАНИЯ ПЛАЗМЫ КРОВИ ФРАГМЕНТАМИ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН, включающий определение времени рекальцификации в смеси исследуемого образца с субстратной плазмой, отличающийся тем, что время рекальцификации определяют в субстратной плазме, содержащей фрагменты клеточных мембран исследуемого образца, а их свертывающая активность оценивается по калибровочной кривой, построенной по зависимости времени рекальцификации субстратной плазмы от свертывающей активности фрагментов клеточных мембран.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3