Способ получения фагового препарата "стрептофагин"

 

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: для приготовления препарата "Стрептофагин" предлагается использовать 4 вирулентных мутанта умеренных фагов Streptococcus bovis ВМ 6/6, ВМ 32/6, ВМ 28/28 и ВМ 54/54, размножение которых проводят на индикаторных культурах Streptococcus bovis БТ -6, БТ -28 и БТ -54 соответственно. Культуры выращивают на среде, имеющей следующий состав, г/л: гидролизат древесных отходов 10-25, автолизат кормовых дрожжей 10-25, двууглекислый натрий 5-11 и дистиллированная вода 1л. Чувствительные культуры инкубируют при 38-39^oС и при достижении ими оптической плотности 0,55-0,91 ед. инфицируют фагами с множественностью инфекции 0,1-1 и продолжают культивирование до наступления лизиса. Нативный фаголизат фильтруют через фильтры с диаметром пор не более 0,2 мкм и стерильные фаголизаты фасуют по флаконам (жидкая форма) или используют для получения сухого препарата. В качестве наполнителей применяют кукурузную муку, ячменные отруби и сульфат аммония при массовых соотношениях 1-3:1-10 (наполнитель/фаг). Жидкая и сухая формы стрепофагина могут храниться при + 4-6^oС до 29 и 15 мес соответсвенно. 1 з. п. ф-лы, 6 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и касается производства нового биопрепарата стрептофагина для животноводства.

Известен способ приготовления бактериофагов Streptococcus bovis (стрептофагин), включающий культивирование чувствительных к бактериофагам штаммов стрептококков до экспоненциальной фазы роста (3-5 ч) на питательной среде, содержащей пептон, гидролизат казеина, цистеин солянокислый и сульфат аммония в качестве источников азота и аминокислот, глюкозу и мальтозу в качестве источников энергии и углерода, набор минеральных солей и воду, инфицирование культур фагом Str.bovis с множественностью инфекции 0,1-1,0 и последующее их инкубирование при 38-39^оС в течение 4-5 ч до максимального просветления фаголизата. Выход фага, получаемого по этому способу, варьирует в пределах 10⁹ 10¹⁰ частиц/мл.

Недостатком этого способа является сложный состав и высокая стоимость питательной среды, используемой для получения бактериофага, а также отсутствие способа приготовления кормовых форм препарата стрептофагина для использования в животноводстве.

Целью изобретения является получение новых штаммов вирулентных мутантов умеренных бактериофагов Str.bovis, пригодных для приготовления жидкой и сухой форм стрептофагина, удешевление питательной среды для их размножения и повышения выхода целевого продукта.

Указанная цель достигается тем, что при получении нового биопрепарата стрептофагина используют 4 спонтанных вирулентных мутанта умеренных фагов Str. bovis ВМ 6/6, ВМ 32/6, BM 28/28 и ВМ 54/54, которые размножают на индикаторных культурах Str.bovis БТ-6, БТ-6, БТ-28 и БТ-54 соответственно, выращиваемых в биологически полноценной питательной среде, обеспечивающей повышение выхода бактериофагов в 1-16 раз и многократное (в 75 раз) снижение затрат на компоненты питательной среды.

Технология получения жидкой и сухой форм препаратов бактериофагов (стрептофагина) сводится к получению в реакторе жидкого фаголизата, его фильтрации через стерилизующие фильтры с диаметром пор 0,2 мкм и фасовки по флаконам, в случае жидкого препарата, или смешивания стерильного фаголизата с наполнителями, предпочтительно с кукурузной мукой или ячменными отрубями, и лиофильного высушивания до влажности 8-10% в случае сухого препарата.

П р и м е р 1. Используемые для приготовления стрептофагина штаммы бактериофагов Str.bovis имеют следующие свойства.

Штамм бактериофага Str.bovis ВМ 6/6 (ВКПМ РН-715) 1. Происхождение. Вирулентный мутант умеренного фага Str.bovis ВМ 6/6 выделен из спонтанно лизировавшейся лизогенной культуры Str.bovis БТ-6.

2. Морфология негативных колоний (бляшек). Фаг Str.bovis ВМ 6/6 на газоне индикаторного штамма Str.bovis ВТ-6/6 образует округлые с достаточно четким краем негативные колонии от 0,5 до 1,5 мм в диаметре.

3. Вирулентность. Фаг ВМ 6/6 лизирует культуры Str.bovis ВТ-6, БТ-28 и БТ-54.

4. Скорость и степень адсорбции. При множественности инфекции равной 0,02 и инкубации адсорбционной смеси при 39^оС за 5 мин адсорбируется 88,9% фага.

5. Латентный период и урожай фага. Латентный период более 20 мин и менее 25 мин (≈22,5 мин). Нарастание титра фагов происходит с 25 по 35 мин. Средний урожай фага составляет 63 фаговых частицы на одну клетку.

6. Титр фага в нативном фаголизате варьирует в пределах 3,93 ± 1,1 х 10¹⁰, а остаточное количество нелизировавшихся жизнеспособных клеток индикаторного штамма 2,43 ± 0,47 х 10⁶.

Штамм бактериофага Str.bovis ВМ 32/6 (ВКПМ РН-716).

1. Происхождение. Вирулентный мутант умеренного фага Str.bovis ВМ 32/6 выделен из спонтанно лизировавшейся лизогенной культуры Str.bovis БТ-32.

2. Морфология негативных колоний. Фаг Str.bovis ВМ 32/6 на газоне индикаторного штамма Str.bovis БТ-6 образует округлые с достаточно четким краем негативные колонии от 0,5 до 1,5 мм в диаметре.

3. Вирулентность. Вирулентен для культур Str.bovis БТ-6, БТ-28, БТ-54.

4. Скорость и степень адсорбции. При множественности инфекции равной 2,24 и инкубации адсорбционной смеси при температуре 39^оС за 5 мин адсорбируется 99,5% фага.

5. Латентный период и урожай фага. Латентный период более 20 мин и менее 25 мин (≈22,5 мин). Нарастание титра фагов происходит с 25 до 35 мин. Средний урожай фага составляет 73 фаговых частицы на одну клетку.

6. Титр фага в нативном фаголизате варьирует в пределах 6,22 ± 0,82 х 10¹⁰, а остаточное количество нелизировавшихся жизнеспособных клеток индикаторного штамма находится на уровне 3,4 ± 0,61 х 10⁷.

Штамм бактериофага Str.bovis ВМ 28/28 (ВКПМ РН-689) 1. Происхождение. Вирулентный мутант умеренного фага Str.bovis ВМ 28/28 выделен из спонтанно лизировавшейся лизогенной культуры Str.bovis БТ-28.

2. Морфология негативных колоний. Фаг ВМ 28/28 на газоне индикаторного штамма Str.bovis БТ-28 образует округлые с достаточно четким краем негативные колонии от 0,5 до 2 мм в диаметре.

3. Вирулентность. Из 93 исследованных культур Str.bovis, выделенных из рубца овец и коров, 19 оказались чувствительны к данному фагу. Этот фаг лизирует также культуры Str.bovis БТ-6 и БТ-54.

4. Скорость и степень адсорбции. При множественности инфекции равной 0,03 и инкубации адсорбционной смеси при 39^оС за 5 мин адсорбируется 96,6% фага.

5. Латентный период и урожай фага. Латентный период более 25 мин и менее 30 мин (≈27,5 мин). Нарастание титра фагов происходит с 30 по 40 мин. Средний урожай фага составляет 40 фаговых частиц на одну клетку.

6. Титр фага в нативном фаголизате варьирует в пределах 11,25 ± 1,31 х 10¹⁰, а остаточное количество нелизировавшихся жизнеспособных клеток индикаторного штамма 2,33 ± 0,32 х 10⁶.

Штамм бактериофага Str.bovis ВМ 54/54 (ВКПМ РН-717).

1. Происхождение. Вирулентный мутант умеренного фага Str.bovis ВМ 54/54 выделен из спонтанно лизировавшейся лизогенной культуры Str.bovis БТ-54.

2. Морфология негативных колоний. Фаг Str.bovis ВМ 54/54 на газоне индикаторного штамма Str.bovis БТ-54 образует округлые с ровным четким краем негативные колонии от 0,5 до 1,5-1,7 мм в диаметре.

3. Вирулентность. Фаг ВМ 54/54 лизирует культуры Str.bovis БТ-6, БТ-28 и БТ-54.

4. Скорость и степень адсорбции. При множественности инфекции равной 0,5 и инкубации адсорбционной смеси при 39^оС за 5 мин адсорбируется 99,6% фага.

5. Латентный период и урожай фага. Латентный период более 20 мин и менее 25 мин (≈22,5 мин). Нарастание титра фага происходит с 25 по 35 мин. Средний урожай фага составляет 74 фаговых частицы на одну клетку.

6. Титр фага в нативном фаголизате варьирует в пределах 9,57 ± 2,82 х 10¹⁰, а остаточное количество нелизировавшихся жизнеспособных клеток индикаторного штамма не превышает 0,7 ± 0,19 х 10⁶.

П р и м е р 2. Выход фагов при размножении в известной и предлагаемой средах.

Берут известную питательную среду по прототипу и предлагаемую, которую готовят по следующим 4 рецептам (табл. 1.).

Рекомендуемые для среды компоненты изготовляются в промышленном масштабе из непищевого сырья, сравнительно недороги и могут быть введены в состав питательной среды без дополнительной обработки.

Гидролизат древесных отходов в абсолютно сухом веществе содержит (в) гексоз 45,7-68,2; пентоз 11,9-39,2; сахаристого остатка 5-10,8; золы 4,8-6,1; сырого протеина 1,2-1,5; сырого жира 0,5-1,1 и лигнина 2.

Автолизат кормовых дрожжей (паприна) представляет собой светло-желтый порошок, в абсолютно сухом веществе которого содержится (в) сырого протеина 61-64; растворимого белка 16,25-20,7; аминного азота 4,5-7,9; растворимых нуклеотидов не более 2,5; общих углеводородов не более 2; липидов не более 16 и золы 9,2-9,7. Паприн содержит следующие витамины, мг/кг сухого вещества: тиамин 4, рибофлавин 180, пиридоксин 25, ниацин 430, пантотеновая кислота 125, фолиевая кислота 6, аминобензойная кислота 40, холин 8300 и инозитол 3265.

Предлагаемая питательная среда полностью удовлетворяет потребности индикаторных штаммов в элементах питания, факторах роста и лизиса, что позволяет повысить выход фагов на единицу использованной среды.

Питательную среду готовят следующим образом. Необходимые на 1 л среды навески компонентов вносят в литровую колбу, добавляют воду, тщательно перемешивают и фильтруют через вату. Затем доводят объем среды до 1 л и устанавливают рН в пределах 7-7,2. Приготовленный бульон разливают в пробирки по 10 мл, закрывают резиновыми пробками и стерилизуют в автоклаве при 0,5 атм. 30 мин.

Сравнительную оценку выхода фага при лизисе культур ведут на предлагаемой и известной средах. Для этого используют 4 вирулентных мутанта умеренных фагов Str.bovis ВМ 6/6, ВМ 32/6, ВМ 28/28 и ВМ 54/54, которые размножают на соответствующих индикаторных культурах. В пробирки с 10 мл среды вносят по 0,5 мл суточной индикаторной культуры и инкубируют при 38-39^оС. Спустя 3-5 ч в начале экспоненциальной фазы роста, культуры инфицируют фагами в дозе 0,1 мл и продолжают культивирование еще 4-5 ч до наступления лизиса культуры, который наблюдается визуально. Готовые нативные (неочищенные) фаголизаты до титрования хранят в холодильнике при 4^оС.

Титрование осуществляют методом агаровых слоев. Для нижнего слоя используют среду следующего состава, г/л: К₂НРО₄ 0,5; КН₂РО₄ 0,2; (NH₄)₂SO₄ 0,5; NaCl 1,0; MgSO₄ ˙ 7H₂O 0,1; CaCl₂ 0,1; NaHCO₃ 5,0; глюкоза 5,0; мальтоза 3,0; пептон 10,0; гидролизат казеина 5,0; цистеин солянокислый 0,7; агар-агар 15,0. В качестве верхнего слоя применяют 0,7%-ный мясопептонный агар, содержащий по 0,5% глюкозы и мальтозы и 0,1% твина 80.

Разведения фаголизатов готовят на 0,85%-ном растворе хлорида натрия до 10^-9, а посев проводят следующим образом. В пробирку с расплавленной и остуженной до 48-50оС средой для верхнего слоя (3 мл) вносят 0,5 мл 4-5 часовой индикаторной культуры и перемешивают. На поверхность нижнего слоя наносят 0,5 мл разведения фаголизата, выливают из пробирки среду для верхнего слоя с индикаторной культурой и, покачивая чашку в горизонтальной плоскости, тщательно перемешивают. Спустя 1 ч после посева и затвердения верхнего слоя чашки инкубируют 18-20 ч при 38-39^оС, а затем проводят подсчет негативных колоний (бляшек).

Результаты исследований представлены в табл. 2.

Из представленных в табл. 2 результатов видно, что использование предлагаемой среды в сравнении с известной повышает выход фагов: ВМ 6/6 в 3,9-11,5 раза; ВМ 32/6 в 1,3-16,8 раза; ВМ 28/28 в 4,4 7,4 раза; и ВМ 54/54 в 2,4 6,3 раза.

П р и м е р 3. При промышленном получении бактериофагов Str.bovis их размножение проводят в реакторе на соответствующих индикаторных культурах. В реактор к стерильной среде добавляют 2,5-5% по объему суточной бульонной индикаторной культуры, перемешивают и инкубируют культуры при 38-39^оС. После 3-4 часового культивирования в экспоненциальной фазе роста, когда оптическая плотность культуральной суспензии достигнет 0,55-0,91 ед. оптической плотности, в реактор вносят бактериофаг из расчета 1 инфекционная фаговая частица на 1-10 бактериальных клеток. Латентный внутриклеточный период размножения фагов составляет 35-40 мин. Через 5-6 генераций фага, длящихся 3,5- 4 ч, наступает видимый лизис бактериальных клеток, сопровождающийся просветлением культуральной среды до оптической плотности 0,03-0,08 ед.

Получаемые таким образом нативные фаголизаты, имеющие титр фагов порядка 3,93-11,25 ˙ 10¹⁰ и остаточные количества жизнеспособных фагоустойчивых клеток в пределах 0,7 ˙ 10⁶ 3,4 ˙ 10⁷ мл (табл. 3), непосредственно из реактора фильтруют через стерилизующие фильтры с диаметром пор не более 0,2 мкм. Затем после проведения контроля на стерильность фаголизаты фасуют по флаконам, герметически укупоривают, этикетируют и хранят при +4-6^оС до применения. Эту жидкую форму препарата стрептофагина используют непосредственно для скармливания животным.

П р и м е р 4. Сухую форму стрептофагина получают путем лиофильного высушивания стерильного фаголизата вместе с различными наполнителями.

Берут бактериофаги Str.bovis ВМ 6/6, ВМ 32/6, ВМ 28/28 и ВМ 54/54 и смешивают их с комбикормом или кукурузной мукой в соотношении 1:1 по массе, с ячменными отрубями в соотношении 2:1 и сульфатом аммония 10:3 (фаг/наполнитель), замораживают в морозильной камере при -20-45^оС и высушивают под вакуумом до влажности 8-10% Определение титра фагов в сухих препаратах, проведенное аналогично примеру 2, показало, что бактериофаги ВМ 6/6, ВМ 32/6, ВМ 28/28 и ВМ 54/54 имеют неодинаковую устойчивость к высушиванию. Так, фаг ВМ 6/6 при лиофлизации со всеми испытанными наполнителями проявлял минимальную выживаемость (11,4-20,7% ), фаг ВМ 32/6 максимальную (38,4 77,6%), а фаги ВМ 28/28 и ВМ 54/54 занимали промежуточное положение (табл. 4). Кроме индивидуальной чувствительности фагов на их сохранность в сухих препаратах отчетливое действие оказывают наполнители. Минимальная выживаемость всех фагов наблюдалась при использовании в качестве наполнителя комбикорма, имеющего следующий состав, кукуруза 49,7; рожь 20; отруби 15; шрот соевый 10; травяная мука 2; фосфат 2; соль поваренная 0,3 и премикс Л51-71. При применении кукурузной муки заметно возрастала сохранность фагов ВМ 6/6, ВМ 32/6 и ВМ 54/54, тогда как для фага ВМ 28/28 она существенно не изменялась. Сохранность бактриофага ВМ 32/6 в этом наполнителе была максимальной и достигала 77,6% У фагов ВМ 28/28 и ВМ 54/54 максимальная выживаемость (39,6-46,7%) достигалась при высушивании с ячменными отрубями. Сульфат аммония обеспечивал высокую сохранность (43,9-50,2%) фагов ВМ 32/6 и ВМ 28/28 и низкую фага ВМ 54/54.

П р и м е р 5. Оценку активности фаговых частиц в жидкой и сухих формах стрептофагина в связи с продолжительностью и температурой хранения препаратов проводили по методу агаровых слоев аналогично примеру 2.

Сравнительные исследования жидкого препарата показали, что хранение его в холодильнике при +4-6^оС обеспечивает высокую инфекционную активность фаговых частиц в течение 29 мес, тогда как выдерживание препарата при комнатной температуре +18-22^оС сопровождается полной потерей активности фаговых частиц уже после 8-месячного хранения (табл. 5).

Титрование сухих препаратов, изготовленных на основе комбикорма, кукурузной муки и ячменных отрубей показало, что их хранение при +4-6^оС гарантирует высокую активность фагов (исключение ВМ 28/28 с комбикормом) в течение 15 мес (табл. 6). Экспозиция препаратов при +18-22^оС сопровождается более высокой степенью инактивации фагов, но тем не менее в течение 3-месячного периода хранения большинство препаратов сохраняет титр инфекционных фаговых частиц, достаточный для обеспечения положительного действия на продуктивность животных при скармливании препарата в рекомендуемой дозе 25 г на голову в день. После 7-месячного хранения при комнатной температуре высокую активность сохраняли фаги ВМ 6/6 и ВМ 32/6, тогда как титр фагов ВМ 28/28 и ВМ 54/54 снижался на 1-3 порядка. Учитывая тот факт, что минимальная эффективная доза активных фаговых частиц составляет 3,5 ˙ 10⁹ частиц/голову в день, препараты с титром фага ниже 1,4 ˙ 10⁸/г могут быть использованы в кормлении животных, но только после корректировки суточной дозы, исходя из фактической концентрации активных фаговых частиц.

Что касается препаратов фагов, содержащих в качестве наполнителя сульфат аммония, то высокая их активность сохранялась при +4-6^оС и +18-22^оС только в течение трех месяцев. При дальнейшем хранении препаратов титр фагов в них снижался в сравнении с исходным на 2-3 порядка. Использовать в кормлении коров препарат стрептофагина на основе сульфата аммония с титром фагов ниже 3,5 ˙ 10⁷ частиц/г не представляется возможным, поскольку в этом случае появляется риск непосредственного токсического действия сульфата аммония на организм животных.

Изготовляемые по предлагаемой технологии жидкая и сухая формы стрептофагина имеют следующие характеристики Жидкий препарат представляет собой жидкость от соломенно-желтого до светло-коричневого цвета, без специфического запаха, содержащую 2-3% сухого вещества. Сухой препарат представляет собой мелкодисперсный порошок от белого до темно-серого или желтовато-бежего цвета, в зависимости от цвета использованного наполнителя, без специфического запаха с массовой долей влаги 8-10% Титр активных фаговых частиц в 1 мл жидкого или 1 г сухого препарата находится в пределах 1-5 ˙ 10⁹. Число посторонних микробных клеток в 1 мл жидкого или 1 г сухого препарата не превышает 150 ˙ 10³, а наличие патогенной микрофлоры не допускается.

Препарат стрептофагин предназначен для скармливания высокопродуктивным лактирующим коровам, содержащимся на высококонцентратных рационах (более 40% концентратов по питательности), в качестве средства регуляции микробиологических и метаболических процессов в рубке, обеспечивающего повышение жиpности молока и эффективности использования корма.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФАГОВОГО ПРЕПАРАТА "СТРЕПТОФАГИН", предусматривающий культивирование при 38 39^oС чувствительных к бактериофагам штаммов стрептококков на питательной среде, содержащий источники азота, аминокислот, углеводы, минеральные соли и воду, инфицирование культур фагом Streptococcus bovis ВМ 28/28 с множественностью заражения 0,1 1,0 и их лизис до максимального просветления фаголизата, отличающийся тем, что дополнительно используют новые штаммы вирулентных мутантов умеренных бактериофагов ВКПМ РН-715, ВКПМ РН-716 и ВКПМ РН-717, которые размножают на индикаторных культурах Str.bovis БТ6, БТG и БТ-54, соответственно выращиваемых на питательной среде, содержащей в качестве источника углеводов гидролизат древесных отходов, а в качестве одновременного источника азота, аминокислот и витаминов автолизат кормовых дрожжей при следующем соотношении компонентов, г/л: Гидролизат древесных отходов 10 25 Автолизат кормовых дрожжей 10 25 Двууглекислый натрий 5 11 Дистиллированная вода, л 1
причем в питательную среду суточные индикаторные культуры добавляют из расчета 2,5 5% к объему среды и по достижении культурой оптической плотности 0,55 0,91 ед. ее инфицируют бактериофагом и продолжают инкубацию до наступления лизиса, сопровождающегося снижением оптической плотности до 0,03 - 0,08 ед. полученные фаголизаты фильтруют через стерилизующие фильтры с диаметром пор 0,2 мкм, проверяют на стерильность, фасуют, укупоривают, этикетируют и хранят при 4 6^oС.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что при получении сухого препарата стрептофагина к свободному от жизнеспособных клеток индикаторной культуры фаголизату добавляют кукурузную муку, ячменные отруби, сульфат аммония в массовых соотношениях 1 1, 1 2 и 3 10 соответственно, тщательно перемешивают, лиофильно высушивают до влажности 8 10% и хранят при температуре 4 6^oС до применения.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4