Способ получения диагностикума эритроцитарного сыпнотифозного антигенного сухого

 

Использование: повышение специфичности целевого продукта. Задача: единый диагностикум риккетсий Провачека. Сущность изобретения: корпускулярный сухой обрабатывают тритоном Х-100, выделяют мембранные белки путем центрифугирования и сенсибилизируют ими формалинизированные танизированные эритроциты. Новым в способе является то, что сенсибилизацию эритроцитов проводят при Т 49-51^oC, а в качестве сенситина используют мембранные белки риккетсий Провачека, выделенные из единого антигена риккетсий Провачека при Т от 0 до 4^oC.

Изобретение относится к медицине, а именно к инфекционной иммунологии и может быть использовано при производстве диагностических препаратов с использованием нерастворимых носителей.

В медицинской промышленности для изготовления эритроцитарных риккетсиозных антигенных диагностикумов в качестве нерастворимых носителей используют эритроциты человека и различные сенситины, полученные из очищенных эфиром риккетсий Провачека, культивируемых в желточных оболочках куриных эмбрионов или в кишечнике вшей. (Пшеничнов Р.А, Колотов В.М, Касатова О.А. Жидкий эритроцитарный сыпнотифозный диагностикум для непрямой гемагглютинации. Ж. микробиол. эпидемиол. иммунобиол. 1967, N 9, с. 62-64).

Известные способы приготовления эритроцитарных антигенных диагностикумов не позволяют получать стабильные при хранении препараты, обладающие высокой специфичностью и позволяющие проводить внутригрупповую дифференциацию риккетсиозов группы сыпного тифа.

Известен способ приготовления сухого эритроцитарного сыпнотифозного антигенного диагностикума (СЭСД) на основе формалинизированных и танизированных эритроцитов барана, нагруженных (сенсибилизированных) антигеном риккетсий Провачека, выделенным из корпускулярного антигена риккетсий Провачека с помощью обработки 2%-ным раствором детергента тритона Х-100 (экспериментально-производственный регламент N 400-92 "Диагностикум эритроцитарный сыпнотифозный сухой для РНГА").

Однако существующий способ позволяет получать диагностикум с активностью, не превышающей активность коммерческих жидких препаратов. Кроме того, с его помощью невозможно проводить внутригрупповую дифференциацию риккетсиозов группы сыпного тифа, что важно для эпидемиологов, т.к. комплекс противоэпидемических мероприятий, проводимых при эпидемическом сыпном тифе, отличается от комплекса противоэпидемических мероприятий, проводимых при эндемическом сыпном тифе.

Преимуществом этого диагностикума перед жидким является то, что в качестве нерастворимого носителя используют эритроциты барана, с его помощью выявляются сыпнотифозные антитела у лиц, вакцинированных сыпнотифозной вакциной, он стабилен при хранении и выпускается в ампулах в сухом виде. Однако решить вопрос о повышении специфичности и внутригрупповой дифференциации путем увеличения нагруженности эритроцитов сенситином невозможно, т. к. для приготовления сенситина используют риккетсии Провачека, подвергнутые эфирной обработке, в процессе которой наряду с неспецифическими примесями удаляются и специфические антигены, отвечающие за внутригрупповую дифференциацию.

Изобретение направлено на решение задачи: повышение специфичности целевого продукта.

Для этого единый диагностикум риккетсий Провачека корпускулярный сухой обрабатывают тритоном Х-100, выделяют мембранные белки путем центрифугирования и сенсибилизируют ими формалинизированные танизированные эритроциты.

Существенные признаки заявляемого способа: ограничительные - сенсибилизация формалинизированных и танизированных эритроцитов барана тритоновым антигеном риккетсий Провачека и центрифугирование; отличительные - сенсибилизацию эритроцитов проводят при температуре 49 51^oC, в качестве сенситина используют мембранные белки риккетсий Провачека, выделенные из единого антигена риккетсий Провачека при температуре 0 4^oC.

Способ осуществляют следующим образом. 50 мл единого диагностикума (диагностикума риккетсиозного Провачека корпускулярного сухого для реакции связывания комплемента РСК, реакции нейтрализации антигена РНАг, метода флуоресцирующих антител МФА) регидратируют в 50 мл дистиллированной воды, осаждают риккетсии путем центрифугирования при 10000 мин^-1 в течение 30 минут, а осадок ресуспендируют в 50 мл 10 mM трисHCl буферного раствора, содержащего 2% тритона Х-100. Инкубация суспензии в течение 1 часа при Т от 0 до 4^oC. Затем смесь центрифугируют при 10000 мин^-1 в течение 30 минут, осадок, представляющий собой мембранные белки риккетсий Провачека, ресуспендируют в 50 мл 0,9%-ного раствора хлорида натрия. Полученные мембранные белки риккетсий Провачека (сенситин) используют для сенсибилизации формалинизированных танизированных эритроцитов барана. Для определения рабочей дозы проводят пробную сенсибилизацию. С этой целью в 5-ти пробирках готовят последовательные двукратные разведения сенситина (с 1:4 1:64) в объеме 1 мл на фосфатном буферном растворе pH 6,4. В каждую пробирку добавляют по 1 мл 6% -ной взвеси формалинизированных танизированных эритроцитов барана. Пробирки помещают в термостат и выдерживают в течение 1 часа при Т 49 51^oC. Затем эритроциты в пробирках осаждают центрифугированием при 1500 мин^-1 в течение 5 минут, осадок 2 раза отмывают в 0,9%-ном растворе хлорида натрия с добавлением инактивированной и истощенной нормальной лошадиной сыворотки до концентрации 1% Затем осадок ресуспендируют в 4 мл такого же раствора, т.е. получают 2 мл 3% сенсибилизированных эритроцитов (СЭ).

В лунках полистиролового 96-луночного планшета готовят последовательные двукратные разведения (с 1:125 до 1:64000) стандартной сыворотки к риккетсиям Провачека. Затем в лунки первого ряда вносят по 0,025 мл СЭ из пробирки с разведением 1: 4, в лунки второго ряда из пробирки 1:8 и т.д. Проводят постановку контроля каждой пробы на спонтанную агглютинацию. Реакцию проводят при Т 20 22^oC в течение 1 часа. Учет результатов проводят по четырехкрестовой шкале. За рабочее разведение принимают максимальное разведение сенситина, обеспечивающее четкую агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов стандартной сывороткой до диагностического титра.

Специфическую чувствительность сенсибилизированных эритроцитов оценивают в РНГА с гетерологичной сывороткой. Выбранное рабочее разведение используют для приготовления 100 мл эритроцитарного антигенного диагностикума. Отконтролированный диагностикум стабилизируют в наполнителе, содержащем полиглюкин до конечной концентрации 50% затем разливают в ампулы по 1 мл и подвергают лиофильному высушиванию.

Пример 1. Получение диагностикума по способу прототипу. Содержимое 50 ампул с диагностикумом риккетсиозным Провачека для реакции агглютинации регидратируют в 0,9%-ном растворе хлорида натрия, осаждают риккетсии путем центрифугирования при 10000 мин^-1 в течение 30 минут. Осадок гомогенизируют в 50 мл 2%-ного раствора тритона Х-100. Инкубацию смеси проводят при Т 20 22^oC в течение 30 минут, затем центрифугируют при 10000 мин^-1 в течение 30 минут и отбирают надосадочную жидкость, представляющую собой поверхностный антиген риккетсий Провачека. Получено 48 мл поверхностного антигена риккетсий Провачека, который используют для сенсибилизации формалинизированных танизированных эритроцитов барана. Для определения дозы сенситина проводят пробную сенсибилизацию при Т 42 - 44^oC по регламенту N 400-92. Рабочее разведение сенситина равно 1:4. Выбранное рабочее разведение сенситина используют для приготовления 100 мл эритроцитарного риккетсиозного антигенного диагностикума. Целевой продукт, полученный по способу-прототипу имеет активность в РНГА с сывороткой к риккетсиям Провачека 1:1600, с сывороткой к риккетсиям тифи 1:1600, т.е. не наблюдается разницы в титрах.

Пример 2. Получение диагностикума по предлагаемому способу. Содержимое 50 ампул сухого единого диагностикума регидратируют в 50 мл дистиллированной воды, буксируют и отделяют риккетсии путем центрифугирования при 10000 мин^-1 в течение 30 минут. К осадку добавляют 50 мл охлажденного до 2^oC, 10mM триHCl буферного раствора pH 7,4, содержащего тритон Х-100 в конечной концентрации 2% Взвесь риккетсий инкубируют при 0 4^oC в течение 1 часа. Заданный режим температуры обусловлен тем, что при температуре выше 4^oC снижается специфическая активность диагностикума, а при температуре ниже 0^oC происходит замерзание смеси. Затем взвесь центрифугируют при 10000 мин^-1 в течение 30 минут, надосадочную жидкость удаляют, а осадок ресуспендируют в 50 мл 0,9% -ного раствора хлорида натрия и гомогенизируют. Полученную смесь, состоящую из мембранных белков, используют в качестве сенситина для приготовления специфического эритроцитарного диагностикума. Предварительно проводят пробную сенсибилизацию по методике, описанной выше. Рабочее разведение сенситина равно 1:16. Для приготовления 100 мл эритроцитарного диагностикума используют 3,2 мл сенситина в исходном разведении. К 50 мл сенситина в разведении 01: 16 на фосфатном буферном растворе pH 6,4 приливают 50 мл 6% танизированных формалинизированных эритроцитов и смесь выдерживают на водяной бане при температуре 49 - 51^oC в течение 1 часа, периодически, каждые 15 минут, встряхивая. При температуре менее 49^oC происходит снижение нагруженности эритроцитов сенситином, а при температуре выше 51^oC наступает инактивация препарата. Затем нагруженные сенситином (сенсибилизированные) ФТЭ осаждают центрифугированием при 1500 мин^-1 в течение 5 минут. К осадку добавляют 200 мл 1%-ного раствора нормальной лошадиной сыворотки и вновь осаждают эритроциты центрифугированием. Осадок сенсибилизированных и отмытых ФТЭ ресуспендируют в 97 мл 1%-ного раствора нормальной лошадиной сыворотки. Целевой продукт, полученный по способу, указанному в заявке, имеет активность в РНГА с сывороткой к риккетсиям Провачека 1:50000, с сывороткой к риккетсиям тифи 1: 1600. С гетерологичной сывороткой к риккетсиям сибирика диагностикум не взаимодействует.

Таким образом, полученный по предлагаемому способу диагностикум в 30 раз активнее препарата, приготовленного по способу-протитопу. Кроме того, он позволяет проводить в РНГА внутригрупповую дифференциацию риккетсиозов группы сыпного тифа по разнице в титрах сывороток (в 31 раз) к риккетсиям Провачека и риккетсиям тифи.

Формула изобретения

Способ получения диагностикума эритроцитарного сыпнотифозного антигенного сухого путем сенсибилизации формализированных танизированных эритроцитов барана тритоновым антигеном риккетсий Провачека и центрифугирования, отличающийся тем, что сенсибилизацию эритроцитов проводят при 49-51^oС, а в качестве антигена используют мембранные белки риккетсий Провачека, выделенные из единого антигена риккетсий Провачека при 0-4^oС.

PD4A - Изменение наименования обладателя патента Российской Федерации на изобретение

(73) Новое наименование патентообладателя:Федеральное государственное унитарное предприятие “Научно-производственное объединение по медицинским иммунобиологическим препаратам “Микроген”

Извещение опубликовано: 10.10.2004        БИ: 28/2004

---