Способ получения компонентов пчелиного яда

 

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам получения и очистки биологически активных веществ из природного вида сырья, в частности из пчелиного яда. Задачей изобретения является упрощение способа выделения компонентов пчелиного яда. Способ включает растворение лиофильно высушенного препарата пчелиного яда в аммонийно-ацетатном буферном растворе, центрифугировании и разделении полученного супернатанта методом электрофореза в свободном потоке аммонийно-ацетатного буфера при pН 9,6 - 10,0, удельной электропроводности 0,7 - 1,0 мСм/см, при средней напряженности электрического поля 40 - 50 В/см, времени разделения 200 - 240 с и скорости подачи образца 1 - 2 мл/ч. 3 ил.

Изобретение относится к биохимии, а именно к способам получения и очистки биологически активных веществ из природного вида сырья, в частности из пчелиного яда.

Известен способ получения фосфолипазы пчелиного яда хроматографическими методами, заключающийся в использовании гель-фильтрации на Сефадексе G-50 и ионообменной хроматографии на SE-сефадексе G-50 с последовательно применяемыми тремя различными значениями pН: 8,25, 7,25 и 9,1 (Shipolini R.A. Callewaert G.L. Cottrell R.C. Doonan S. Vernon C.A. Banks B.E.C. Eur. J. Biochem. 1971, v.20, p.459-468). Данный способ за 4 этапа позволяет получить в гомогенном виде лишь один компонент пчелиного яда фосфолипазу.

Известен способ получения мелиттина основного компонента пчелиного яда, заключающийся в использовании гель-фильтрации на Сефадексе G-50, ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе при pН 4,75 и обессоливании на Cефадексе G-25 (Maulet Y. Mathey-Prevot B. Kaiser G. Ruegg U.T. Fulpius B.W. Purification and chemical characterisation of melittin and acetilated derivates. Biochem. Biophys. Acta, 1980, v.625, p.274-280). Недостатком данного способа также является многоэтапность и получение только одного компонента в гомогенном виде.

Наиболее близким по достигаемым результатам является способ получения компонентов пчелиного яда хроматографическими методами, заключающийся в использовании гель-фильтрации на Cефадексе G-50 для выделения 4 основных компонентов пчелиного яда мелиттина, фосфолипазы, апамина и гиалуронидазы с последующей их доочисткой ионообменной хроматографией на КМ-целлюлозе с применением четырех различных буферных растворов и значений pН (King P. Sobotka A.K. Kochoumian L. Lichtenstein L.W. Allergens of honey bee venom. - Arc. biochem. biophys. 1976, v.172, N 2, p.661-671).

Известный способ получения компонентов пчелиного яда довольно трудоемкий, многоэтапный, в нем используют несколько видов хроматографического фракционирования и различные буферные растворы для каждого компонента.

Цель изобретения упрощение способа выделения и увеличение производительности.

Поставленная цель осуществляется следующим способом. Лиофильно высушенный препарат пчелиного яда растворяют в аммонийно-ацетатном буфере, центрифугируют для удаления нерастворившихся веществ и полученный супернатант подвергают электрофорезу в потоке аммонийно-ацетатного буфера с pН 9,6 10,0, удельной электропроводностью 0,7 1,0 мСм/см, при средней напряженности электрического поля 40 50 В/см, времени разделения 200 240 с и скорости подачи образца 1 2 мл/ч. В результате последовательного выполнения этих операций удается выделить фракции, содержащие чистые компоненты пчелиного яда мелиттин и фосфолипазу.

На фиг.1 показана принципиальная схема установки ЭФСП, используемая для выделения компонентов пчелиного яда; на фиг.2 график распределения отдельных компонентов пчелиного яда после электрофореза в свободном потоке на выходе из камеры разделения; на фиг.3 график распределения вещества после электрофореза в свободном потоке.

Установка состоит из разделительной камеры, которую образуют отдельные камерные секции 1 при помощи соединительных фланцев 2. Каждая камера имеет электродные отделения 3 с электродами из платиновой проволоки. Центробежный насос 6 обеспечивает прокачивание раствора электролита через электродные отделения. От стабилизированного источника питания 10 на электроды подается напряжение, создающее в камере поперечное электрическое поле Е. В верхней части камеры расположен инжекционный узел 4, внизу многоканальный коллектор фракций 5. Многоканальный перистальтический насос 7 обеспечивает прокачивание через разделительные камеры несущего буферного раствора из емкости 12. С помощью насоса 11 и системы боковых каналов в камере создается поперечный смещающий поток несущего буфера. Одноканальный перистальтический насос 9 обеспечивает подачу в камеру через капиллярный инжектор разделяемого образца.

Образец выносится в поток несущего буферного электролита, протекающего в виде тонкого плоского слоя вдоль электрофоретической камеры. В процессе прохождения вдоль камеры отдельные компоненты образца под действием поперечного электрического поля отклоняются на различные углы в соответствии с их электрофоретической подвижностью. Разделенные фракции в конце камеры попадают в различные каналы коллектора и собираются в отдельные пробирки. При помощи системы бокового смещения при необходимости можно регулировать местоположение выхода той или иной фракции в коллектор.

Для отвода выделяющейся в несущем буферном электролите тепловой мощности разделительные камеры оснащены двухсторонними рубашками охлаждения, через которые прокачивается хладагент от холодильной установки (на фиг.1 система охлаждения не показана).

Пример 1. Препараты отдельных компонентов пчелиного яда мелиттина, фосфолипазы, апамина и гиалуронидазы растворяют в 0,01 М аммонийно-ацетатном буфере pН 10,0. Готовят растворы с концентрацией 4 мг/мл и со скоростью 2 мл/ч подают в электрофоретическую камеру 1, в которой через электродные отделения 3 от источника питания 10 подается постоянное электрическое напряжение.

Несущий аммонийно-ацетатный буфер с pН 9,6 и удельной электропроводностью 0,7 мСм/см непрерывно подается в рабочий зазор камеры из емкости 12. Образец и поток несущего буфера непрерывно отбирается на выходе камеры с помощью коллектора 5 с набором пробирок. После отбора фракций в отдельные пробирки определяют распределение оптической плотности вдоль электрического поля камеры с помощью спектрофотометра в кювете с длиной оптического пути 10 мм на длине волны 280 нм. На фиг.2 показаны результаты распределения для мелиттина (А), фосфолипазы (С), апамина (B) и гиалуронидазы (D) пчелиного яда после электрофореза в свободном потоке, проведенного отдельно с каждым компонентом. Из рисунка видно, что полипептиды отличаются по электрофоретической подвижности и имеют разное отклонение в электрическом поле. Подобные результаты получают при использовании аммонийно-ацетатного буферного раствора с pН 10,0 и удельной электропроводностью 1,0 мСм/см.

Пример 2. Сухой препарат пчелиного яда растворяют в 0,01 М аммонийно-ацетатном буфере pН 10,0. Осадок отделяют центрифугированием, а pН супернатанта доводят до значения 10,0. Со скоростью 1-2 мл/ч супернатант инжектируют в электрофоретическую камеру, через которую проходит поток аммонийно-ацетатного буферного раствора. В электродные отделения от источника питания подается постоянное электрическое напряжение. При этом в камере создается средняя напряженность электрического поля 40 В/см, что обеспечивает оптимальное разделение компонентов пчелиного яда при времени нахождения в электрическом поле 240 с. Аналогичные результаты получают при напряженности 50 В/см и времени разделения 200 с. Поглощение фракций, полученных при разделении препарата методом электрофореза в свободном потоке, анализируют на спектрофотометре на длине волны 280 нм. В качестве электрофоретической камеры используют 3-х секционную установку с общей эффективной рабочей длиной 55 см.

На фиг.3 показан результат распределения вещества после электрофореза в свободном потоке на выходе из камеры разделения. Стрелкой указано место ввода образца в камеру. Из рисунка видно, что вещество на выходе из камеры распределено в виде трех частично перекрывающихся пиков. Аналогичный результат получают при pН 9,6 и удельной электропроводности буфера 0,7 мСм/см.

С помощью метода аналитического электрофореза в полиакриламидном геле установлено, что в первом пике (фракции 20-28) находится мелиттин, в третьем пике (фракции 40-44) фосфолипаза, а второй пик представляет смесь мелиттина и апамина. Получаемые препараты мелиттина и фосфолипазы электрофоретически и хроматографически чисты и не содержат примесей. Специальные биологические тесты показывают также, что выделенные препараты мелиттина и фосфолипазы обладают соответствующей биологической активностью. Для выделения чистого препарата апамина требуется проведение повторного фракционирования в электрофоретической установке материала второго пика, представляющего смесь мелиттина и апамина, при выше описанных условиях или же увеличения разрешающей способности электрофоретической установки путем увеличения произведения E·t.

Известный способ получения компонентов пчелиного яда хроматографическими методами включает несколько стадий: на 1 этапе пчелиный яд фракционируют методом гель-фильтрации, далее проводят доочистку полученных компонентов методами ионообменной хроматографии с использованием различных сорбентов и буферных систем.

Предлагаемый способ получения компонентов пчелиного яда позволяет вести процесс выделения в непрерывном режиме, упростить процедуру, сократить время выделения 2-х основных компонентов мелиттина и фосфолипазы, не требует использования хроматографического оборудования и различных сорбентов.

Формула изобретения

Способ получения компонентов пчелиного яда путем растворения лиофильно высушенного препарата пчелиного яда в аммонийно-ацетатном буферном растворе, центрифугирования для отделения нерастворившихся веществ и последующей очистки целевого продукта, отличающийся тем, что очистку проводят электрофорезом в свободном потоке буферного раствора при pH 9,6-10,0 и с удельной электропроводностью 0,7-1,0 мСм/см при средней напряженности электрического поля 40-50 В/см, времени разделения 200-240 с и скорости подачи образца 1-2 мл/ч.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3