Способ получения мукополисахарида - кератосульфата

 

Изобретение относится к области химии полисахаридов, конкретно к способу получения кератосульфата - высокомолекулярного полисахарида, выполняющего роль скользящего и связующего материала в организме и используемого в биохимических исследованиях и офтальмологической практике. Изобретение решает задачу повышения выхода кератосульфата. Указанный результат достигается тем, что в способе получения кератосульфата, включающем гомогенизацию животного сырья, его экстракцию, отделение экстракта, депротеинизацию, осаждение 50-60%-ным этиловым спиртом, растворение осадка, очистку хроматографией на колонке с целлюлозой и сушку, в качестве животного сырья используют трахеи телят, экстракцию проводят 5 -6 объемами 0,5-1%-ного водного раствора едкого натра при 40-60^oC в течение 3-4 ч, депротеинизацию осуществляют встряхиванием экстракта с 3-4 объемами хлороформа в течение 1-2 ч., осадок после обработки экстракта этиловым спиртом растворяют в 1-2 объемах 0,2-0,4%-ного раствора соляной кислоты, а очищенный кератосульфат получают промыванием колонки с целлюлозой 1-2%-ным раствором метилпиридинийхлорида, при этом перед экстракцией сырье обезжиривают многократным промыванием ацетоном.

Изобретение относится к области химии полисахаридов, конкретно к способу получения кератосульфата высокомолекулярного полисахарида, выполняющего роль скользящего и связующего материала в организме и используемого в биохимических исследованиях и в офтальмологической практике.

Известны способы получения кератосульфата из роговицы быка и из межреберного хряща больных людей с нарушениями функций скелета (J.Biol.Chem. - 1953, v. 205. pp. 611-635, а также Biochim. Biophys. Acta. 1958. v. 30. р. 184). Выход целевого продукта составляет, однако, не более 0,08 0,1% от исходной массы сырья.

Известен также способ получения кератосульфата согласно источнику (Acta Chem. Scand. 1957. v.11.р.р. 668-674), в соответствии с которыми животное сырье центральную часть межпозвоночных хрящей человеке гомогенизируют, лиофилизируют, экстрагируют кипящей водой, экстракт отделяют, депротеинизируют инкубацией с экстрактом поджелудочной железы, кератосульфат осаждают 50-60% -ным этиловым спиртом, осадок растворяют в 0,3%-ном растворе ацетата бария, очищают хроматографией на колонке с целлюлозой при использовании в качестве элюента раствора этилового спирта с последующей сушкой элюата сублимацией. Недостаток этого способа заключается в низком выходе целевого продукта (0,12-0,32% от исходной массы сырья).

Согласно принятому за прототип, наиболее близкому к заявляемому техническому решению по (авт. свид. СССР N 918294), терапевтически активный сложный полиэфир серной кислоты с мукополисахаридом из трахей крупного рогатого скота (кератосульфат) выделяют путем фракционирования низшим алифатическим спиртом (этиловым спиртом) сырой мукополисахаридной смеси, полученной экстракцией трахей; последующим осаждением при pH 1-2 и температуре 20^o 30-34 об. -ным раствором этилового спирта, а затем 70-74 об. этиловым спиртом, гидролизом осадка соляной кислотой и сульфатированием хлорсульфоновой кислотой в диметилфомамиде, диализом 5%-ного раствора продукта при pH 9-10 и температуре 4-25^o через полые волоконные мембраны с границей исключения ≅ 5000, очисткой на сильнокислотной катионообменной смоле и обесцвечиванием H₂O₂. Из 10 кг трахей получают 71,5 г продукта. Недостаток описанного выше способа состоит в его сложности, в необходимости использования опасного и агрессивного химического соединения хлорсульфоновой кислоты, а также длительности процесса очистки диализом. Изобретение решает задачу упрощения процесса выделения кератосульфата из трахей крупного рогатого скота при сохранении высокого выхода целевого продукта.

Поставленная цель достигается тем, что в способе получения кератосульфата из трахей крупного рогатого скота, включающем их обезжиривание ацетоном и гомогенизацию, экстракцию водным раствором щелочи, обработку щелочного экстракта водным раствором этилового спирта с выделением осадка, гидролиз полученного осадка соляной кислотой с последующей хроматографической очисткой целевого мукополисахарида, экстракцию обезжиренных и гомогенизированных трахей крупного рогатого скота проводят 5-6 частями 0,5-1%-ного водного раствора едкого натра при 40-60^o в течение 3-4 ч, экстракт дополнительно депротеинизируют встряхиванием с 3-4-мя объемами хлороформа в течение 1-2 ч, депротеинизированный экстракт обрабатывают 50-60% -ным этиловым спиртом, гидролиз полученного осадка осуществляют в 1-2 частях 0,2-0,4%-ного раствора соляной кислоты, а хроматографическую очистку целевого продукта - кератосульфата проводят хроматографированием полученного солянокислого раствора на колонке, заполненной целлюлозой, с 1-2%-ным водным раствором цетилпиридинийхлорида в качестве элюента, с последующей лиофильной сушкой.

Выход кератосульфата по заявленному способу составляет 0,58-0,62% исходной массы сырья, что почти не уступает величине выхода по известному способу (0,715%), однако заявленный способ проще в исполнении, безопаснее и не столь продолжителен (благодаря исключению ClSO₃H и стадии диализа).

Изобретение поясняется примерами 1-3.

Пример 1: 1 кг трахей телят измельчают на мясорубке, гомогенизируют в микроизмельчителе тканей, фарш обезжиривают обработкой ацетоном (4 х 4л) в течение 6 ч, сушат до удаления запаха ацетона и порошок экстрагируют 5 л (5 объемов) 0,5% -ного водного раствора NaCH при 40^oC в течение 3 ч. Смесь охлаждают до 20^o, экстракт отделяют фильтрованием на нутч-фильтре, к 4,6 л раствора добавляют 13,3 л хлороформа (3 объема) и встряхивают на шуттель-аппарате в течение 1 ч. Водную фазу отделяют от хлороформа, содержащего белки, на делительной воронке и добавляют 4 объема 50%-ного этилового спирта. Через 1 ч. образовавшийся осадок отделяют фильтрованием и растворяют в 1 л 0,2%-ного раствора HCl (1 объем от массы исходного сырья), раствор пропускают через колонку (5х35 см) с порошком целлюлозы со скоростью 15 мл/мин. колонку вымывают 1% -ным водным раствором цетилпиридинийхлорида, элюат сушат сублимацией и получают 5,3 г (выход 0,38%) очищенного кератосульфата.

Пример 2: 1 кг измельченных и гомогенизированных трахей телят обезжиривают ацетоном (4 х 4 л), сушат и порошок экстрагируют 5,5 л (5,5 объемов) 0,75% -ного водного раствора NaCH при 50^oC в течение 3,5 ч. Смесь охлаждают до 20^oC, экстракт отделяют фильтрованием, к 5 л раствора добавляют 17,5 л хлороформа (3,5 объема и встряхивают в течение 1,5 ч. Водную фазу отделяют, добавляют 4 объема 55%-ного этилового спирта, через 1 ч. осадок отфильтровывают, растворяют в 1,5 л 0,3%-ного раствора HCl (1,5 объема от массы исходного вещества-сырья), раствор пропускают через колонку (35 х 5 см) с порошком целлюлозы со скоростью 15 мл/мин, колонку вымывают 1,5%-ным водным раствором цетилпиридинийхлорида, элюат сушат сублимацией и получают 6 г (выход 0,6%) очищенного кератосульфата.

Пример 3: 1кг измельченных и гомогенизированных трахей телят обезжиривают обработкой ацетоном, сушат порошок экстрагируют 6 л (6 объемов) 1%-ного водного раствора NaOH при 60^oC в течение 4 ч. Смесь охлаждают до 20^oC, экстракт отделяют фильтрованием, к 5,6 л раствора добавляют 22,4 л хлороформа (4 объема) и встряхивают 2 ч. Водную фазу отделяют, добавляют 4 объема 60%-ного этилового спирта, через 1 ч. осадок отфильтровывают, растворяют в 2 л 0,4%-ного раствора HCl (2 объема от массы исходного сырья), раствор пропускают через колонку (5 х 35 см) с порошком целлюлозы со скоростью 15 мл/мин. колонку вымывают 2%-ным водным раствором цетилпиридинийхлорида, элюат сушат сублимацией и получают 6,2 г (выход 0,62%) очищенного кератосульфата.

Продукт не содержит примесей других полисахаридов, о чем свидетельствует наличие одного единственного пятна с R_F 0,73 при хроматографии образца на бумаге (метод восходящей хроматографии на бумаге в системе растворителей н-бутиловый спирт концентрированный аммиак вода, 4:1:5).

Формула изобретения

Способ получения мукополисахарида кератосульфата из трахей крупного рогатого скота, включающий их обезжиривание ацетоном и гомогенизацию, экстракцию водным раствором щелочи, обработку щелочного экстракта водными растворами этилового спирта с выделением осадка, гидролиз полученного осадка соляной кислотой с последующей хроматографической очисткой целевого мукополисахарида, отличающийся тем, что экстракцию обезжиренных и гомогенизированных трахей крупного рогатого скота проводят 5 6 ч. 0,5 - 1%-ного водного раствора едкого натра при 40 60^oС в течение 3 4 ч, экстракт дополнительно депротеинизируют встряхиванием с 3 4 объемами хлороформа в течение 1 2 ч, депротеинизированный экстракт обрабатывают 50 - 60%-ным этиловым спиртом, гидролиз полученного осадка осуществляют в 1 2 ч. 0,2 0,4%-ного раствора соляной кислоты, а хроматографическую очистку целевого продукта кератосульфата проводят хроматографированием полученного солянокислого раствора на колонке, заполненной целлюлозой, с 1 2%-ным водным раствором цетилпиридинийхлорида в качестве элюента с последующей лиофильной сушкой.