Устройство для выполнения иммунохимического определения

 

Устройство для выполнения иммунохимического определения содержит по меньшей мере один патрон с отверстием сверху, вовнутрь патрона нанесено первое иммунохимически активное вещество и он закрыт сверху съемным закрывающим средством, причем патрон содержит по меньшей мере второе иммунохимически активное вещество, которое в отсутствии контрольной среды в той форме, в которой указанное второе иммунохимически активное вещество содержится в закрытом патроне, во время хранения и транспортировки при нормальных условиях не проявляет взаимодействия с внутренней поверхностью патрона и является инертным по отношению к нанесенному на поверхность патрона иммунохимически активному веществу. Устройство также содержит твердую, более или менее сферическую высушенную вымораживанием частицу, содержащую второе иммунохимически активное вещество. 4 з.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к устройству для выполнения иммунохимического определения, содержащему по меньшей мере один патрон, сверху которого предусмотрено отверстие, а внутрь нанесено иммунохимически активное вещество (1AS1).

В известном устройстве такого типа иммунохимически активное вещество наносится внутрь патрона с целью уменьшить количество операций, которые необходимо произвести для выполнения иммунохимического определения. Уменьшение количества операций важно по двум соображениям: прежде всего оно важно для организаций, выполняющих большое количество таких определений, и во-вторых, оно важно при иммунохимическом определении в полевых условиях, когда количество возможных ошибок будет тем меньше, чем меньше число выполняемых операций. В этом и заключается побудительная причина к разработке таких устройств.

Так, например, для выполнения так называемого определения по Сэндвичу необходимо добавить кроме контрольной среды по меньшей мере еще точно известное количество второго иммунохимически активного вещества. После инкубации и промывки патрона исследуемое вещество можно, как правило, определить количественно или качественно. Добавка второго иммунохимически активного вещества в строго определенных количествах является источником ошибок, а при большом количестве определений оказывается и трудоемкой. Поэтому желательно создать устройство, в патроне или патронах которого уже содержится второе иммунохимически активное вещество с тем, чтобы у специалиста отпала необходимость в добавлении этого вещества при выполнении определения.

Одно из возможных решений проблемы приведено в патенте США N 4017597. Второе иммунохимически активное вещество добавляется в патрон, покрытый первым иммунохимически активным веществом, в растворенной форме и затем второе иммунохимически активное вещество замораживается примерно при -78^oC на протяжении от 5 до 15 с и лиофилизуется. Другой способ, когда второе иммунохимически активное вещество вводится как порошок, считается возможным, но непрактичным. Однако, хотя эти способы и являются решением проблемы по исключению необходимости в добавке второго иммунохимически активного вещества персоналом, проводящим иммунохимическое определение, но они обладают рядом недостатков.

Прежде всего, хотя и кратковременно, но второе иммунохимически активное вещество присутствует в растворенной форме в покрытой пробирке. Если первое иммунохимически активное вещество является антителом, а второе иммунохимически активное вещество является соответствующим антигеном, то произойдет какое-то взаимодействие. Кроме того, будет иметь место взаимодействие между стенкой и вторым иммунохимически активным веществом.

Во-вторых, для охлаждения большого количества пробирок или микротитровых пластинок требуются технически сложные и дорогие меры.

Затем для лиофилизации большого числа пробирок или микротитровых пластинок требуются очень большие и дорогие лиофилизационные помещения.

Данное изобретение обеспечивает создание устройства, для которого отпадает необходимость в добавлении второго иммунохимически активного вещества персоналом, проводящим иммунохимическое определение, а также отпадают недостатки, присущие известным устройствам, что достигается благодаря внесению твердой, высушенной вымораживанием более или менее сферической частицы, содержащей второе иммунохимически активное вещество. Такую частицу получают до того, как второе иммунохимически активное вещество сможет контактировать с внутренней стенкой пробирки либо с первым иммунохимически активным веществом.

Итак, данное изобретение относится к устройству для выполнения иммунохимического определения, содержащему по меньшей мере один патрон с отверстием сверху, внутрь патрона нанесено иммунохимически активное вещество и он закрыт сверху съемным закрывающим средством, причем патрон содержит по меньшей мере второе иммунохимически активное вещество, которое в отсутствии контрольной среды в той форме, в которой указанное второе иммунохимически активное вещество содержится в закрытом патроне, во время хранения и транспортировки при нормальных условиях не проявляет взаимодействия с внутренней поверхностью патрона и является инертным по отношению к нанесенному на него первому иммунохимически активному веществу, отличающемуся тем, что патрон содержит твердую, высушенную вымораживанием более или менее сферическую частицу, заключающую второе иммунохимически активное вещество.

Как было сказано выше, частицу получают до того, как второе иммунохимически активное вещество (1AS2) входит в контакт с внутренней стенкой пробирки или с первым иммунохимически активным веществом (1AS1). Благодаря этому устраняются вышеперечисленные недостатки. Далее устройство по данному изобретению обладает повышенной степенью значимости, то есть предел обнаружения устройства по данному типу лучше в сравнении с устройством по патенту США N 4017597. Хотя причины этого улучшения до настоящего времени до конца не ясны, но оно является весьма примечательным.

Было обнаружено, что селективность, чувствительность и специфичность определений, проводимых с помощью устройства по данному изобретению, проявляют такое же качество даже после длительного хранения, что и способ определения с помощью известного устройства, где второе иммунохимически активное вещество добавляется во время определения.

Устройство содержит по меньшей мере один патрон. Если в состав устройства входит лишь один патрон, то оно может состоять из пробирки, внутри которой предусмотрено первое иммунохимически активное вещество и которая содержит второе иммунохимически активное вещество, не проявляющее взаимодействия с внутренней стенкой и являющееся инертным по отношению к первому иммунохимически активному веществу, причем верх патрона закрыт крышкой. Пробирки и крышки такого типа сами по себе известны и могут состоять из стекла либо синтетического полимера, например полистирола. Желательно, чтобы пробирка была прозрачной. Крышка и пробирка могут изготавливаться из одинакового материала, однако этот момент не существенен. Форма и размеры пробирки могут меняться в широких пределах. Пробирка может быть прямоугольной, конической или полусферической на участке дна, хотя более предпочтительно полусферическое дно. По высоте пробирка может быть от 1 до 10 см, тогда как ее внутренний диаметр может меняться от 0,3 до 5 см, причем предпочтительно от 0,5 до 3 см. Крышка может устанавливаться на пробирке любым известным образом, необходимо лишь, чтобы крышка была съемной и герметично закрывала пробирку.

В устройстве также могут содержаться несколько патронов, причем их число может меняться в широких пределах, например от 2 до 1000 и предпочтительно от 10 до 500 и особенно от 25 до 200. Патроны могут соединяться друг с другом посредством того же материала, из которого состоят они сами. В качестве материалов возможно использование всех тех, что были упомянуты в устройстве на один патрон. Размеры патронов также могут варьироваться в широких пределах. Как правило, размеры таких патронов меньше, чем в устройстве с единичным патроном. Высота может варьироваться от 0,2 до 4 см и предпочтительно от 0,3 до 2 см, тогда как внутренний диаметр от 0,3 до 2 см и предпочтительно от 0,4 до 1,0 см. Типичным устройством с несколькими патронами является так называемая микротитровая пластинка, в которой каждый патрон запечатан отдельным закрывающим средством. Желательно использование такой микротитровой пластинки, в которой предусмотрены взаимно соединенные закрывающие средства. Типичным средством для такой цели является пластинка, снабженная стойками, выступающими на 1-3 мм и закрывающими патрон герметичным образом. В частности, для этой цели может быть использована пластина с выступами из силоксанового каучука.

На внутренней стенке патрона или патронов предусматривается иммунохимически активное вещество (1AS1), наносимое туда известным образом посредством ковалентной связи или адсорбции. Для этого можно ввести раствор или суспензию первого иммунохимически активного вещества в патрон или патрон и спустя некоторое время, например через 3-24 ч, удалить раствор или суспензию из патрона. В результате адсорбции первое иммунохимически активное вещество останется внутри благодаря сцеплению с внутренней стенкой патрона или патронов. Как правило, первое иммунохимически активное вещество предусматривается не более чем на 80% поверхности внутренней стенки для предотвращения смещения этого вещества при закрывании патрона закрывающим средством.

Если в устройстве содержится несколько патронов, то первое иммунохимически активное вещество может быть предусмотрено на внутренней стенке патронов, и во всех патронах может содержаться второе иммунохимически активное вещество, однако выполнение этого требования не обязательно. Может быть желательным, чтобы устройство содержало один или несколько патронов, где отсутствует первое или второе или и первое, и второе иммунохимически активные вещества или их сочетание, при котором может проводиться холостое определение. Для калибровочных определений в некоторых патронах могут содержаться, кроме частиц со вторым иммунохимически активным веществом, еще одна твердая, высушенная вымораживанием более или менее сферическая частица, содержащая определяемое вещество.

Второе иммунохимически активное вещество должно находиться в патронах в такой форме, чтобы при хранении или транспортировке при нормальных условиях оно не взаимодействовало с внутренней поверхностью патронов либо с первым иммунохимически активным веществом. С этой целью второе иммунохимически активное вещество подвергают обработке до того, как оно вступит в контакт с внутренней поверхностью патрона и с первым иммунохимически активным веществом. Далее, для устройств такого типа особенно важно, чтобы в них имелось строго известное количество иммунохимически активного вещества. Частицы, находящиеся в патронах устройства по данному изобретению, образуются из капли водного раствора или суспензии второго иммунохимически активного вещества; такая капля имеет точно известный и воспроизводимый объем, желательно 0,025-0,070 мл, и в ходе получения она свободно падает через несмешивающуюся с водой холодную жидкость, плотность которой меньше плотности воды, затем смерзшиеся шарики собирают со дна и высушивают вымораживанием. В результате получают твердые, стабильные, более или менее сферические частицы, содержащие точно известное и воспроизводимое количество второго иммунохимически активного вещества и имеющие диаметр примерно 3,6-5,2 мм. В этой связи слова "более или менее сферические" означают ту форму, которую приобретает капля воды при свободном падении через жидкость, замораживающую эту каплю.

К водному раствору или суспензии второго иммунохимически активного вещества желательно добавить такое вещество, которое придает твердость высушенным при вымораживании частицам, то агент повышения жесткости, например один из сахаров сахарозу, маннозу, лактозу и маннит, и такие белковые вещества, как сывороточный белок, гидролизат лактальбумина и гидролизат казеина. В результате в полученной частице будет содержаться загуститель.

В качестве несмешивающихся с водой жидкостей можно использовать такой углеводород или галогенированный углеводород или их смесь, как гексан, хлороформ, гептан, изооктан, толуол, смеси гексана с хлороформом и смеси бензола с гексаном либо такие криогенные жидкости, как жидкий азот или жидкий кислород. На донной поверхности жидкого столба температура несмешивающейся с водой жидкости должна быть ниже -50^oC.

В той своей форме, в которой второе иммунохимически активное вещество находится в закрытом патроне, оно при отсутствии контрольной среды не должно проявлять взаимодействия с внутренней стенкой патрона и должно быть инертным по отношению к первому иммунохимически активному веществу при хранении и транспортировке устройства при нормальных условиях. В данном контексте слова "не проявляет взаимодействия" и "инертное" означает либо отсутствие какой-либо связи с внутренней стенкой патрона и первым иммунохимически активным веществом, либо такую связь, которая не оказывает нежелательного влияния на качество определений, проводимых в опытах с устройством по данному изобретению. "Нормальные условия" означают условия, обычные для хранения и транспортировки известных сравнимых устройств. Как правило, при хранении и транспортировке поддерживается температура от -25 до +37^oC и предпочтительно от -20 до +20^oC и нормальное атмосферное давление.

Для дополнительного повышения качества определений, выполняемых с помощью такого устройства, оно сушится без уплотнительного средства и второго иммунохимически активного вещества; затем в патроны вводятся высушенные вымораживанием твердые более или менее сферические частицы, заключающие второе иммунохимически активное вещество, что желательно выполнять в сухом помещении, и наконец, патроны герметично закрываются с помощью закрывающего средства, что также желательно проводить в сухом помещении.

Весьма часто при испытаниях контролируемая система должна буферироваться. С этой целью патрон или патроны устройства по данному изобретению могут содержать высушенную вымораживанием более или менее сферическую частицу, содержащую буферный материал и полученную таким же образом, как и частица из второго иммунохимически активного материала. Однако более предпочтительно применение частицы, полученной из водного раствора или суспензии второго иммунохимически активного вещества, которая содержит соответствующее количество требуемого буферного материала. Таким образом, высушенная вымораживанием более или менее сферическая частица из второго иммунохимически активного вещества содержит и буферный материал.

В патроне или патронах устройства по данному изобретению могут при необходимости содержаться несколько иммунохимически активных веществ (1AS3, 1AS4 и т.д.), при условии, что упомянутые вещества соответствуют критериям, поставленным перед вторым иммунохимически активным веществом, а также при условии, что эти вещества являются инертными по отношению друг к другу и к второму иммунохимически активному веществу в указанных выше условиях. Третье, четвертое и т.д. иммунохимически активные вещества желательно обрабатывать таким же образом, как второе иммунохимически активное вещество с тем, чтобы получить высушенные вымораживанием более или менее сферические частицы из третьего, четвертого и т.д. иммунохимически активных веществ. Контрольным методом, при котором используется устройство по данному изобретению с патронами, содержащими частицы из второго и третьего мммунохимически активного вещества, является проба на ингибирование, когда в состав третьего иммунохимически активного вещества входит вещество, являющееся иммунологически эквивалентным или иммунологически комплементарным к определяемому иммунохимически активному веществу. Устройство по данному изобретению может использоваться и в иных контрольных методах, например тесте по Сэндвичу и сравнительном тесте, когда достаточно использование лишь одной частицы из второго иммунохимически активного вещества.

С помощью устройства по данному изобретению и в зависимости от примененных первого и второго (а при необходимости и третьего) иммунохимически активных веществ, а также в зависимости от выбранного метода испытания можно определять антитела, антигены и гаптены.

В тесте по Сэндвичу первое и второе иммунохимически активные вещества являются антителами, если следует определять антиген, и антигенами или анти-антителами, если следует определить антитело. Первое и второе иммунохимически активные вещества могут быть оба поликлональными или моноклональными антителами при условии, что если первое и второе иммунохимически активные вещества являются моноклональными антителами против определяемого антигена, то антитела первого иммунохимически активного тела часто должны быть направлены против другой антигенной детерминанты, чем антитела второго иммунохимически активного вещества. Если в определяемом веществе имеется две или более идентичных антигенных детерминанты или же если определяемое вещество хотя и не обладает двумя идентичными детерминантами, но присутствует в контрольной среде в форме скопления, и в скоплении имеются две или более идентичные антигенные детерминанты, то первое и второе иммунохимически активные вещества могут быть моноклональными антителами, направленными против той же антигенной детерминанты.

В сравнительном тесте второе иммунохимически активное вещество является антигеном или гаптеном, если первое иммунохимически активное вещество является моноклональным или поликлональным антителом, тогда как второе иммунохимически активное вещество является моноклональным или поликлональным антителом, если первое иммунохимически активное вещество является антигеном или гаптеном.

Если в пробе на ингибирование первое иммунохимически активное вещество является моноклональным или поликлональным антителом, то второе иммунохимически активное вещество также должно быть моноклональным или поликлональным антителом и третье иммунохимически активное вещество является антигеном или гаптеном, то второе иммунохимически активное вещество должно быть антигеном или гаптеном, а третье антителом. Все приведенные выше указания о предпочтительности справедливы, если первое и второе иммунохимически активные вещества являются моноклональными антителами.

Для того, чтобы сделать возможным определение, во втором иммунохимическом веществе должно быть предусмотрено меченое вещество, либо после инкубации вместе с контрольной средой и промывки патрона оно должно входить в контакт с веществом, которое образует связь со вторым иммунохимически активным веществом и в котором предусмотрено меченое вещество. Желательно, чтобы в самом втором иммунохимически активном веществе было предусмотрено меченое вещество. Таким меченым веществом может быть изотоп или фермент, краситель, флуоресцентное вещество, золь металла или золь красителя, связанная со вторым иммунохимически активным веществом.

Метод иммунохимического определения с помощью устройства по данному изобретению в основном проводится следующим образом. После удаления закрывающего средства в патрон добавляется контрольная жидкость. Затем в течение некоторого времени проводится инкубация. После инкубации жидкость удаляется, а патрон промывается, и если меченое вещество является изотопом, красителем, флуоресцентным веществом или металлической частицей, то можно определить результат пробы. Если же меченое вещество является ферментом, то следует добавить питательную среду, которую фермент преобразует в опознаваемое вещество.

С помощью устройства по данному изобретению можно выполнять такие иммунохимические определения, которые в отношении специфичности, чувствительности и селективности не уступают определениям, проводимым с устройствами, к которым в ходе определения или вскоре после него добавляется второе и при необходимости третье иммунохимическое вещество, даже если устройство по данному изобретению хранилось несколько месяцев.

Пример 1 В четырех полистирольных микротитровых пластинках содержится 8 рядов из 12 конически цилиндрических патронов (высота 10 мм, диаметр вверху 6,5 мм, диаметр внизу 6 мм) с плоским дном, причем патроны заполнены 0,135 мл водного раствора, содержащего первое иммунохимически активное вещество. Через 16 ч жидкость удалили и микротитровые пластинки высушили в воздухе в течение 24 ч при 20^oC и относительной влажности менее 20% Первая и вторая микротитровые пластинки были сразу использованы для нескольких определений, причем после добавки контрольной среды в патрон первой микротитровой пластинки была добавлена капля водного раствора второго иммунохимически активного вещества, а в патроны микротитровой пластинки номер 2 добавили частицу, содержащую второе иммунохимически активное вещество и полученную в соответствии с вышеприведенными указаниями из капли того же объема и той же концентрации второго иммунохимически активного вещества, что и капля, добавленная к патронам первой микротитровой пластинки. К патронам третьей и четвертой микротитровых пластинок в сухом помещении были добавлены частицы, содержащие второе иммунохимически активное вещество и полученные согласно приведенным выше указаниям из капли того же объема и той же концентрации второго иммунохимически активного вещества, что и капля, добавленная к патронам первой микротитровой пластинки. В некоторые патроны также были добавлены частицы, содержащие третье иммунохимически активное вещество. Затем третья и четвертая микротитровые пластинки в том же сухом помещении были загерметизированы с помощью закрывающего средства, снабженного выступами из силоксанового каучука высотой 2,5 мм, герметично закрывающего патроны микротитровых пластинок, и пластинки хранились 1 нед и 3 мес соответственно при 18^oC и нормальном атмосферном давлении.

В патронах 2, 3 и 4 микротитровых пластинок использовались частицы, полученные из раствора, содержащего точно известные количества второго иммунохимически активного вещества, буферного вещества и сахарозы. С помощью капельной пипетки капли в 0,05 мл свободно падали в сосуд Дьюара, заполненный на 80 см жидким азотом. На дне получались твердые, более или менее сферические частицы, высушиваемые с помощью вымораживания. Частицы с содержанием третьего иммунохимически активного вещества получались таким же образом.

Сами определения проводились следующим образом. После добавки контрольной среды, содержащей точно известное количество определяемого вещества, некоторое время при 37^oC проводилась инкубация; за ней следовала промывка буферным раствором и распознавание. Если в качестве меченого вещества использовался фермент (пероксидаза), то до распознавания проводился этап дополнительной инкубации с использованием питательной среды, содержащей перекись. В различных примерах распознавание проводилось по колориметрическому способу.

Примеры 1, 4, 7, 10, где проводилось определение HBsAg, выполнялись идентично с учетом того, что в примере 1 использовалась капля, а в примерах 4, 7 и 10 частицы, содержащие второе иммунохимически активное вещество, а также варьировалось время проведения пробы после добавки частиц в патроны. Все сказанное относится и к примерам из групп 2, 5, 8, 11 и 3, 6, 9, 12, где проводилось определение HCG и тестостерона соответственно. Каждый из примеров выполнялся 10 раз.

Из представленных результатов видно, что качество определений, проведенных с помощью устройства по данному изобретению, является таким же, как и качество определений, проведенных с помощью известных устройств. Достоинством устройства по данному изобретению по сравнению с известными является то, что у персонала, проводящего определение, отпадает необходимость добавлять в патроны точно известное количество второго иммунохимически активного вещества.

Пример 2.

В двух микротитровых пластинках 23 патрона были покрыты M-анти-HBsAg, как и в примере 1. Затем к покрытым патронам первой микротитровой пластинки добавили 0,050 мл водного раствора, содержащего анти-HBsAg, меченый пероксидазой, при температуре 0^oC. Раствор заморозили за 15 с при -78^oC, и микротитровые пластинки высушили вымораживанием в течение 16 ч. К покрытым патронам другой микротитровой пластинки добавили частицу, содержащую анти-HBsAg, меченый пероксидазой, и полученную согласно указаниям из примера 1. Затем на обеих микротитровых пластинках были проведены ферментные иммунопробы с 19 различными человеческими сыворотками, не содержащими HBsAg, и с двумя сыворотками, содержащими 0,1 V/мл и 1,0 V/мл соответственно. Пробы и распознавание выполнялись так же, как и в примере 1.

Степень значимости рассчитывалась по формуле (X-Y)/Z, где X является средним для величин, измеренным для сыворотки, содержащей 0,1 или 1,0 VHB Ag/мл, Y среднее значений, найденных для сывороток, не содержащих HBsAg, и Z стандартное отклонение Y.

Из результатов, представленных в таблице, ясно видно, что для устройства по данному изобретению предел обнаружения ниже, чем для устройства по патенту США N 4017597 (чем выше степень значимости, тем ниже предел обнаружения.

V/мл единицы HBsAg, в соответствии с определением Института Пауля Эрлиха (Франкфурт, ФРГ) на мл.

Формула изобретения

1. Устройство для выполнения иммунохимического определения, содержащее по меньшей мере одну емкость, которая снабжена отверстием в верхней части, на внутреннюю поверхность которой нанесено первое иммунохимически активное вещество и которая сверху закрыта съемной крышкой и содержит по меньшей мере второе иммунохимически активное вещество в отсутствии контрольной среды и в том виде, каком это второе иммунохимически активное вещество содержится в закрытой емкости, при хранении и транспортировке в нормальных условиях не взаимодействующее с внутренней поверхностью емкости и инертное к нанесению на внутреннюю поверхность емкости первому иммунохимически активному веществу, отличающееся тем, что емкость содержит твердую более или менее сферическую высушенную при вымораживании частицу, которая содержит второе иммунохимически активное вещество.

2. Устройство по п.1, отличающееся тем, что частица содержит буферный материал.

3. Устройство по п.1 или 2, отличающееся тем, что частица содержит вещество, повышающее ее жесткость.

4. Устройство по пп.1 3, отличающееся тем, что оно содержит 2 1000 емкостей.

5. Устройство по п.4, отличающееся тем, что оно содержит титрационный микропланшет.

РИСУНКИ

Рисунок 1