Способ получения очищенных частиц поверхностного антигена гепатита в, очищенная частица поверхностного антигена гепатита в человека и вакцина против гепатита в

 

Изобретение относится к вирусологии. Сущность изобретения состоит в том, что получают очищенную частицу поверхностного гепатита В человека, состоящую, мас. %: S24 кД негликозилированный 6,24; S27 кД гликолизированный 15,6; pre-S2-33 кД моногликозилированный 10,8; pre-S1-39 кД негликолизированный 6,1, pre-S1-41 кД гликозилированный 1,9, рrе 2-36 кД дигликолизированный 3,2%. На основе указанной частицы и приемлемого носителя создана вакцина против гепатита. 7 з.п. ф-лы, 4 табл, 7 ил.

Заражение вирусом гепатита В (ВГВ) является проблемой здравоохранения мирового значения. ВГВ приводит к неизлечимым, а иногда и фатальным заболеваниям печени, поражающим, как установлено, только в США 20000 новых жертв ежегодно. На Дальнем Востоке, в Африке и Восточной Европе около 10% населения являются хроническими носителями ВГВ, вследствие чего хронический активный гепатит и цирроз печени являются основной причиной смертности. Кроме того, имеются серьезные свидетельства того, что носители ВГВ гораздо более подвержены раку печени, а ВГВ относится к одним из немногих вирусов, для которых известно участие в раковых заболеваниях человека.

Таким образом, существует настоятельная необходимость в создании безопасной и экономически приемлемой вакцины для защиты от инфицирования ВГВ. Предложено несколько подходов создания подобной вакцины (Tiollais и др. Nature 317, 489-495 (1985), Palzer и др. Vaccine 85, 261-264, Коулд Спринг Хорбор (1985) и Zuckerman, Infection 13, 61-71, дополнение А (1986)).

Как указано во всех вышеприведенных обзорах, базовым компонентом всех полученных вакцин является поверхностный антиген гепатита В (HBsAg). Этот антиген первоначально был выделен из плазмы крови хронических больных, инфицированных ВГВ, и был использован в качестве эффективной вакцины против инфицирования ВГВ.

В плазме крови ВГВ-инфицированных носителей HBsAg присутствует как в виде ВГВ инфицирующих 42 нм вирусных частиц (частицы Дейна), так и в виде неинфицирующих 22 нм частиц, свободных от ВГВ-ДНК и других структурных белков ВГВ. У людей хронических носителей ВГВ или в ходе виремии наблюдается перепроизводство 22 нм частиц. Такие 22 нм частицы секретируются трансформируемой ВГВ гепатомной клеточной линией.

В высшей степени иммуногенные 22 нм частицы состоят из шести родственных белков: (а) основных белков-Р-24 в негликозилированной форме с молекулярным весом 2400 дальтон (24 К) и GP-27, являющегося гликозилированной формой Р-24, с молекулярным весом 27000 дальтон (27 К). Белки кодируются S областью генома ВГВ и содержат 226 аминокислот, (в) присутствующих в меньших количествах белков GP-33 в моногликозилированной форме с молекулярным весом 33000 дальтон (33 К) и GP-36 в дигликозилированной форме с молекулярным весом 36000 дальтон (36 К), которые кодируются пред- S2 и S областью генома ВГВ и содержат 281 аминокислот (226 в S области +55 в пред- S2 области), (с) присутствующих в меньших количествах белков Р-39 в негликозилированной форме и GP-42, являющегося гликозилированной формой Р-39, с молекулярными весами соответственно в 39000 и 42000 дальтон (39 К, 42 К), которые кодируются пред- S1, пред- S2 и S областью генома ВГВ и содержат 389-400 аминокислот (226 S +55 пред- S 2+/108-119/ пред-S1). Таким образом, все белки 22 нм частиц HBsAg кодируются одной и той же непрерывающейся последовательностью ВГВ геномной ДНК, а их конечная форма зависит от места инициирования экспрессии гена (транскрипции и трансляции) и от того, происходило и, если происходило, то в какой степени гликозилирование после трансляции.

22 нм частицы HBsAg могут быть образованы из Р-24/ Gp-27(S область), независимо от пред- S2 и пред- S1 продуктов. Недавно показано, что пред- S2 специфичные белки (GP-33 и GP-36), а также пред- S1 специфичные белки (GP-39 и GP-42) обладают антигенными детерминантами, независимыми от Р-24, в результате чего их присутствие в 22 нм частицах HBsAg повышает иммуногенность.

Кроме того, присутствие пред- S2 и пред- S1 белков придает 22 нм частицам HBsAg способность связывать полимеризованный альбумин сыворотки крови человека, что напрямую связано со способностью вирусных частиц ВГВ связывать целевые клетки в ходе инфицирования ВГВ. Таким образом, частицы HBsAg, содержащие детерминанты белков как из пред- S области, так и S области, могут быть использованы в качестве вакцин, вызывающих реакцию, направленную на нейтрализацию вирусных частей и на предотвращение инфицирования этими частицами целевых клеток. В результате подобная вакцина обеспечивает эффективную долговременную защиту от инфицирования ВГВ (Persina и др. Proc.Natl. Acad. Sci. США 82, 3440-3444(1985), Neurath, и др. Nature 315, 154-156(1985), Neurath и др. Cell 46, 429-436(1986) Petit и др. Mol. Immunol. 23,511-523 (1986) и Milich и др. J.Immunol. 137,315-322(1986)).

Способы получения вакцины HBsAg и получаемые этими способами вакцины.

1. Вакцины из плазмы крови. В крови первоначальные вакцины HBsAg, одобренные к применению и используемые в программах иммунизации, получали из плазмы крови хронических носителей ВГВ. Ниже приводятся примеры способов получения вакцин из плазмы крови: (а) вакцина Гептавакс В® производства Мерк, Шарп и Доом (Hilleman и др. J.Infection 7, 3-8, приложение 1(1983)); (в) вакцина Гевак® производства Пастеровского института (Adamowiez и др. Vaceine 2,209-214(1984) и патент США N 4335214, выдан 15 июля 1982 г.).

Обоими вышеприведенными способами, как заявлено, получают из плазмы 22 нм частицы очень высокой чистоты, не содержащие инфекционных примесей, вследствие чего безопасные для применения в качестве вакцин для человека. Однако используемые в обоих способах ключевые стадии длительны и дорогостоящи, поскольку включают фракционирование в полиэтиленгликоле (ПЭГ) или сульфате аммония с последующим ультрацентрифугированием в градиентах сахарозы и хлорида цезия. Описаны и другие более быстрые и более дешевые способы получения из плазмы вакцины HBsAg, но обычно также включающие стадии фракционирования в полиэтиленгликоле (ПЭГ) или сульфате аммония, изопикнического разделения с применением ультрацентрифугирования и хроматографическое разделение на различных хроматографических смолах. Однако и эти все способы дороги и длительны, что приводит к высокой стоимости вакцин на основе плазмы крови человека ("Вакцина гепатита В", под ред. Maupas и Guesry (1981), Эльзевир /Норт Гoлланд Биомедикал Пресс, Амстердам, Нью-Йорк, Оксфорд). И, наконец, основным недостатком вакцин на основе плазмы, содержащих 22 нм частицы HBsAg является их потенциальная опасность для здоровья. Хотя способ получения предусматривают применение материалов, дезактивирующих возможно совместно очищаемые примеси, которые могут включать вирусы СПИД, тем не менее существует потенциальная опасность того, что такие вакцины могут вызвать нежелательные побочные эффекты (Walgate, Nature 304, 297(1983)). По этой причине для получения 22 нм частиц HBsAg для вакцин использована технология генной инженерии, обеспечивающая эффективные и безопасные способы получения частиц HBsAg, не содержащих потенциально опасных примесей, как в случае применения плазмы.

2. Получение вакцин HBsAg методами биотехнологии в прокариотных (Escherichia coli) системах. Описан способ конструирования рекомбинантных векторов и плазмид для экспрессии HBsAg и для очистки HBsAg от прокариотных систем (патент США N 4428941, выдан 31 января 1984, заявки на патенты фирмы Такеда Кем. Индастриз ЕРО 068719 А2, публикация 5 января 1983 г. и WO/86/00640, публикация 30 января 1986 г.). Способы получения HBsAg из таких трансформированных бактериальных систем основаны на тех же методиках, ранее охарактеризованных для получения HBsAg из плазмы. Однако, поскольку подобные прокариотные системы не способны секретировать образовавшийся HBsAg, в этом случае необходима дополнительная стадия лизиса трансформированных клеток. При этом возникает возможность совместной очистки потенциально опасных бактериальных эндотоксинов. Помимо этого прокариотные системы не способны гликозилировать продукты HBsAg, как не способны создавать из них 22 нм частицы. В результате вакцины, полученные этим способом, уступают вакцинам на основе плазмы крови (Charpay и др. Nature 286, 893-895 (1980)).

Таким образом, были созданы эукариотные экспрессионные системы для получения рекомбинантных HBsAg, и такие системы способны давать HBsAg, которые и гликозилированы, и сформированы в 22 нм частицы.

3. Получение вакцин HBsAg в эукариотной клеточной культуре с применением дрожжевых клеток. Примеры вакцин, полученных в эукариотной культуре с применением клеток, включают: продажную вакцину Рекомбивакс НВ® производства Мерк, Шарп и Доом (МШД) (Emini и др. J. Infection 13,3-9, приложение A(1986)) и вакцину рекомбинантных HBsAg производства Смит-Клайн Корп. (патент США N 4649192, выдан 10 января 1987 г. и заявка EPO 199688А, публикация 29 октября 1986 г.) Однако полученные этими способами частицы HBsAg являются продуктами только S области, и не содержат детерминант пред- S2 и пред- S1, поскольку трансформирующая плазмида включает последовательность только S области. Вследствие этого такие частицы не столь иммуногенны, как "естественные" частицы из плазмы. Дрожжевые клетки так же не способны секретировать частицы HBsAg и, хотя они могут гликозилировать белки HBsAg, результат гликозилирования не совпадает с гликозилированием в клетках млекопитающего. Хотя в дрожжах и происходит формирование 22 нм частиц, образовавшиеся частицы нестабильны. Способ получения требует химической обработки полученных из дрожжей HBsAg с целью получения конечного продукта, аналогичного продукту из плазмы, к тому же, чтобы сделать продукт безопасным для человека, необходима, как полагают, обработка формалином. В обоих способах, так же как на стадиях очистки с применением детергентов и мочевины, может произойти структурное изменение молекулы HBsAg, что может привести к потере антигенности и повышению стоимости производства.

Позднее использованы дрожжевые системы с получением частиц HBsAg, содержащих помимо детерминант области так же и пред- S2 детерминантны (EPO 171908A3, публикация 19 февраля 1986 г. Такеда Кем. Инд. Япония и EPO 175261 A2, публикация 26 марта 1986 г. Хирон Корп.). Хотя такие предложенные вакцины и должны содержать детерминанты пред- S2 области, в них, тем не менее, отсутствуют детерминанты пред- S1 области. Кроме того, способы их получения все еще проблематичны, как вышеуказано, вследствие применения дрожжевой системы.

Таким образом, системой для получения вакцин с частицами HBsAg, которая, видимо, наиболее перспективна, оказывается способ с культивированием клеток млекопитающего.

4. Вакцины и способы их получения в системах с культивированием клеток млекопитающего. В системах с культивированием клеток млекопитающего гликозилирование частиц HBsAg такое же, что и в "естественных" частицах ВГВ людей-носителей. Получаемые частицами HBsAg формируются "естественным" путем, не требуя дополнительной химической обработки. И, наконец, 22 нм частицы HBsAg секретируются такими клетками в культурную среду, из которой они могут быть легко выделены без лизина клеток.

Однако основная проблема в синтезе вакцины рекомбинантных HBsAg в культуре тканей млекопитающего заключается в получении полного спектра белков HBsAg, сформированных в аутентичные 22 нм частицы HBsAg. Видимо, белки пред- S1 области (P-39 и GP-42) ингибируют секрецию 22 нм частиц HBsAg (Ou и Rutter, J. Virol. 61, 782-786 (1987), Persing и др. J. Virol. 61, 172-1677 (1987)).

Некоторые потенциальные вакцины HBsAg, получаемые в системе с клетками млекопитающего, используют для направления экспрессии HBsAg гетерологичные онкогенные вирусные экспрессионные векторы (например, SV 40 аденовируса). Такие способы проводят к получению частиц HBsAg, не содержащих детерминанты пред- S1 области, с экспрессией только пред- S2 и S областей. Применение для экспрессии частиц HBsAg гетерологических регулирующих элементов приводит к неэффективному формированию частиц и в результате к более низким выходам. Из-за более низких выходов и отсутствия пред- S1 области, с иммуногенной точки зрения, такая вакцина также несовершенна. И, наконец, способы очистки, описанные для подобных систем, длительны и дороги и, как правило, включают для получения очищенных HBsAq фракционирование в ПЭГ или сульфате аммония с последующим ультрацентрифугированием (EPO 0389765 A1, публикация 28 октября 1981 г. EPO 145589 A3, публикация 19 июня 1985 г. EPO 201416 A1, публикация 12 ноября 1986 г. и EPO 185573 A1, публикация 25 июня 1986 г. право на все эти патенты принадлежат Пастеровскому институту).

Описаны и другие способы получения частиц HBsAg из культур рекомбинантных клеток млекопитающего (EPO 168234 A, публикация 15 января 1986 г. правоприемник Генетик Корп.) Однако и в этой системе также используются дорогостоящие и длительные стадии фракционирования в ПЭГ или сульфате аммония с центрифугированием для получения очищенного продукта. Конечный продукт (частицы HBsAg) в такой системе содержит белки только S области.

Недавно описана система, которая, как заявлено, успешно использует культивирование клеток млекопитающего с получением частиц HBsAg, содержащих белки со всеми иммуногенными детерминантами, а именно: пред- S1, пред- S2 и S. Однако и в этой системе для экспрессии гена применяют гетерологическую регулирующую последовательность (металлотионеиновый промотор мыши), что требует культивирования клеток в присутствии ионов тяжелых металлов и/или стероидных гормонов. Если их затем не удалить из конечного продукта, тот может оказаться потенциально опасным. Кроме того, описанный способ также включает дорогостоящие и длительные стадии фракционирования в ПЭГ и последующего центрифугирования для получения очищенного продукта. Далее из-за применения в экспрессионной системе гетерологических генных регулирующих последовательностей стехиометрия пред- S1, пред- S2 и S детерминант может быть и неидеальной для получения HBsAg продукта с высокой иммуногенностью (EPO 198474 A1, публикация 22 октября 1986 г. правоприемник Эндотроникс).

5. Новый способ получения вакцины в системах с культивированием клеток млекопитающего. В свете вышеприведенных недостатков получения вакцин из рекомбинантных клеток млекопитающего создан новый недорогой способ получения больших количеств высоко очищенных частиц HBsAg, обладающих высокой иммуногенностью и большим сходством с "естественным" продуктом. Такие частицы составляют основу очень эффективной и недорогой вакцины. Кроме того, новый продукт содержит все антигенные детерминанты, а именно детерминанты пред- S1, пред- S2 и S областей, создаваемые в экспрессионной системе с применением "естественных" ВГВ генных регулирующих последовательностей, что приводит к частицам, стехиометрическим аналогичным "естественным" частицам из плазмы крови.

Цель изобретения состоит в создании нового способа получения очищенных частиц поверхностного антигена гепатита B, заключающегося в: (a) культивировании клеток млекопитающего, продуцирующих частицы в культурной среде таким образом, что клетки секретируют частицы поверхностного антигена гепатита B в культурную среду, при этом среда содержит сыворотку, свободную от молекул с молекулярным весом выше 3· 10⁵ дальтон, (b) удалении целых клеток, клеточных осколков и агрегатов частиц из полученной культурной среды, содержащей частицы поверхностного антигена гепатита B, (c) обработке полученной культурной среды с концентрированием и очисткой содержащихся в ней частиц поверхностного антигена гепатита B, (d) выделении полученных концентрированных и очищенных частиц поверхностного антигена гепатита B.

В особенно рекомендуемом способе изобретения очищенные и концентрированные частицы поверхностного антигена гепатита B человека могут быть получены: (a) культивированием клеток млекопитающего, продуцирующих частицы в культурной среде таким образом, что клетки секретируют частицы поверхностного антигена гепатита B человека в культурную среду, при этом среда содержит сыворотку, свободную от молекул с молекулярным весом более 3·10⁵ дальтон, (b) удалением целых клеток, клеточных осколков и агрегатов частиц из полученных культурной среды, содержащей частицы поверхностного антигена гепатита B человека,
(c) обработкой полученной культурной среды с получением раствора, содержащего концентрированные частицы поверхностного антигена гепатита B человека,
(d) обработкой полученного раствора, содержащего концентрированные частицы антигена, с уменьшением в растворе содержания ДНК,
(e) регулированием pH в полученном в результате растворе, содержащем очищенные и концентрированные частицы поверхностного антигена, с установлением, если необходимо, pH в интервале 3-7,
(f) очисткой концентрированных частиц поверхностного антигена, присутствующих в полученном растворе,
(g) выделением очищенных концентрированных частиц поверхностного антигена гепатита B человека.

Более конкретно, изобретение относится к новому способу очистки частиц поверхностного антигена гепатита B, а именно, высокоиммуногенных частиц 22 нм HBsAg. Эти частицы используют в качестве антигена, вызывающего иммунную реакцию для нейтрализации ВГВ вирусной инфекции по отношению к целевым клеткам. Еще более конкретно, способ очистки характеризуется наличием новой стадии предфракционирования, а именно, стадии ультрафильтрования, которую применяют для удаления молекул с молекулярным весом более 3·10⁵ из культурной среды, в которую секретируются частицы поверхностного антигена гепатита B.

Способ очистки по изобретению включает различные стадии. На первой стадии выращивают частицы HBsAg, которые секретируются в культурную среду, содержащую ростовую сыворотку. Культурную среду вначале предфракционируют с удалением клеточных примесей с высоким молекулярным весом, а именно, выше 300 К. Предфракционирование культурной среды, содержащей сыворотку, является важной стадией, позволяющей достигать высокой чистоты с наименьшим числом стадий очистки. Молекулы с молекулярным весом выше 3·10⁵ дальтон включают высокомолекулярные белковые комплексные примеси, первоначально присутствующие в плодной сыворотке теленка, используемой в культурной среде, и их предварительное удаление дает следующие преимущества:
клетки могут быть выращены в культурной среде, содержащей большие количества ПСТ,
рост клеток усиливается, поскольку высокомолекулярные комплексы, возможно, могут ингибировать рост клеток,
очистка HBsAg упрощается, поскольку такие высокомолекулярные белковые комплексы обычно являются основными примесями, удаляемыми в процессах очистки.

На последующих этапах очистки в первую очередь достигается отделение высокомолекулярных частиц HBsAg от низкомолекулярных примесей, например, белковых примесей. Вначале из полученной культурной среды, содержащей частицы поверхностного антигена гепатита B, удаляют целые клетки, клеточные осколки и агрегаты частиц. Затем полученную культурную среду обрабатывают с концентрированием и очисткой содержащихся в ней частиц поверхностного антигена гепатита B, после чего полученные концентрированные очищенные частицы поверхностного антигена гепатита B удаляют. Эти стадии более подробно описаны в последующих примерах, в частности, в примере 5.

В особенно рекомендуемом варианте изобретения получают очищенные концентрированные частицы поверхностного антигена гепатита B человека. Способ включает после первых трех стадий процесса очистки, о котором идет речь в примере 5, т.е. предфракционирование культурной среды, удаление целых клеток, клеточных осколков и агрегатов частиц из собранной культурной среды, содержащей частицы HBsAg, и обработка полученной культурной среды с получением раствора, содержащего концентрированные частицы HBsAg человека, видоизменение вышеописанного процесса очистки. Полученный раствор, содержащий концентрированные частицы антигена, обрабатывают таким образом, что при этом в растворе уменьшается количество ДНК, после чего при необходимости регулируют pH с установлением его в пределах 3-7. В одном рекомендуемом воплощении изобретения pH устанавливают добавлением кислоты до появления помутнения. Образовавшаяся муть содержит белковые примеси и может быть отделена от частиц поверхностного антигена гепатита B. После этого выделяют очищенные концентрированные частицы поверхностного антигена гепатита B человека. Такие отличия и преимущества, достигаемые за их счет, по сравнению со способом, используемым в примере 5, более подробно охарактеризованы в примере II.

С помощью способов изобретения достигают усиленного роста клеток в содержащей ПСТ среде одновременно с возможностью достигать упрощенным путем высокой чистоты секретируемых этими клетками частиц HBsAg. В способе не применяют фракционирования в полиэтиленгликоле (ПЭГ) или сульфате аммония, как не применяют разделения центрифугированием (включая ультрацентрифугирование) или аффинной хроматографией. Способ быстр и эффективен с получением с высокими выходами высокочистого продукта, а поскольку способ основан на компонентах, которые могут быть рециркулированы, то он и не дорог. Таким образом, имеется возможность получать продукт высокой чистоты при очень низкой стоимости. В свою очередь это позволяет получать эффективную вакцину ВГВ с более широким спектром потенциальных потребителей, которые раньше не могли позволить себе гораздо более дорогие продаваемые сейчас вакцины.

Наконец, изобретением даются частицы HBsAg, продуцируемые в системе клеток млекопитающего, которая содержит все встречающиеся в природе антигенные детерминанты (пред- S2, пред- S1 и S) в количествах, отражающих "естественную" стехиометрию. Этот продукт иммуногенен для всех потенциальных потребителей и позволяет преодолеть проблему отсутствия реакции на детерминанты S области или пред- S2 области при наличии также и пред- S1 детерминант (Zuckerman, J. Infection 13, 61-67 (приложение А) (1986)).

На фиг. 1 схематично представлено конструирование pSPHBV8-1. С помощью Pstl происходит гидролитическое расщепление p7.5A126 (11800 п.о.), выделяют фрагмент в 3800 п.о. содержащий ВГВ последовательности, фланкированные ДНК Александера человека, субклонируют в Pstl сайте pSP64 путем легирования T₄ДНК лигазой.

На фиг. 2 схематично представлено конструирование pSPHBVB8. С помощью EcoR1 и Xba1 проводят полное гидролитическое расщепление pSPHBV8-1 с последующим выделением фрагмента в 500 п.о. содержащего HBV-A126 промотор и кодирующую последовательность для пред- S1. Отдельной реакцией с помощью EcoR1 и Psfl проводят гидролитическое расщепление pSPHBV8-1 с выделением фрагмента в 2400 п.о. содержащего кодирующие последовательности для пред- S2 и S, а также выделяют HBV-A126 промотор и сигнал полиаденилирования. Оба фрагмента субклонируют в тандеме в psP65, разрезанной с помощью Xba1 и Pst1 в тройственной процедуре легирования.

На фиг. 3 схематично представлено конструирование pSPHBVA13 и pSPHBVB813. Из pSVE100-dhfr гидролитическим расщеплением с помощью EcoR1 выделяют dhfr ген, флакированный SV40P_E и SV40 сигналом полиаденилирования, с заполнением концов фрагментов Кленова и дальнейшим гидролитическим расщеплением с помощью Sma1. Фрагмент в 1300 п.о. с тупым концом субклонируют в Pvull сайт pSPHBV8-1 и pSPHBVB8 с получением плазмид pSPHBVA13 и pSPHBVB813, которые содержат последовательности для HBsAg, а также dhfr.

На фиг. 4 показано расслаивание частиц HBsAg очищенный HsAg в сахарозе. Частицами нагружают градиент сахарозы в интервале 50-5% ультрацентрифугируемый в роторе Бекман® SW27 при 27000 об/мин, 16-21^oC, 18 ч. Фракции по 1,8 мл, отобранные из нижней части, анализируют на присутствие HBsAg и концентрацию сахароза (рефрактометр).

На фиг. 5 показан твердофазный радиоиммунноанализ на HBsAg используют набор для твердофазного радиоиммунноанализа (травенол):
(a) известные стандарты (Абботт) сравнивают с калибровочной кривой для рекомбинантных HBsAg (CHO) заявителя;
(b) калибровочную кривую вакцины рекомбинантных HBsAg, полученной в клетках СНО (вакцина заявителя (СНО)), сравнивают с калибровочными кривыми для вакцины (HBsAg) из плазмы ( Гептавакс В® ) и для дрожжевой рекомбинантной вакцины ( Рекомбивакс НВ® ).

На фиг. 6 показана активность HBsAg в испытании сероконверсией. Вакцину заявителя (СНО) сравнивают с вакциной на основе плазмы крови ( Гептавакс В® ) и с дрожжевой рекомбинантной вакциной ( Рекомбивакс НВ® ). Машей (Бальб/с) инфицируют внутрибрюшинно 1 мл вакцины (для каждой концентрации вакцины применяют 10 мышей). Через 30 дней после инфицирования мышей обескровливают и сыворотку испытывают на присутствие антител к HBsAg с помощью набора Аусаб EIA^TM ( Абботт® ), калиброванного по ссылочной сыворотке (WHO).

На фиг. 7 показано обнаружение и количественное определение антигенов к S детерминантам у мыши с отсутствием реакции, инъектированной вакциной заявителя в сравнении с дрожжевой рекомбинантной вакциной ( Рекомбивакс НВ® ).

В изобретении предлагается способ получения очищенных частиц поверхностного антигена гепатита B, заключающийся в:
(а) культивировании клеток млекопитающего продуцирующих частицы в культурную среду таким образом, что происходит секретирование клетками частиц поверхностного антигена гепатита B в культурную среду, при этом среда содержит сыворотку, свободную от молекул с молекулярным весом более 3·10⁵ дальтон,
(b) удалении целых клеток, клеточных осколков и агрегатов частиц из полученной культурной среды, содержащей частиц поверхностного антигена гепатита B,
(c) обработке полученной культурной среды с концентрированием и очисткой содержащихся в ней частиц поверхностного антигена гепатита B,
(d) выделении полученных концентрированных и очищенных частиц поверхностного антигена гепатита B.

Полученные вышеприведенным способом частицы могут быть частицами поверхностного антигена гепатита B человека.

Кроме того, дается способ выделения очищенных частиц HBsAq, включающий дальнейшую очистку полученных на стадии (c) частиц HBsAg с удалением низкомолекулярных примесей при пропускании содержащего частицы раствора через хроматографическую колонку и выделении этих частиц. Концентрирование на стадии (c) осуществляют в соответствующих условиях, позволяющих проводить дальнейшую очистку частиц в непрерывной системе очистки.

Важным элементом изобретения является то, что сыворотка, добавляемая в среду с клетками млекопитающего, секретирующими частицы антигена гепатита, например, плодная сыворотка теленка, не содержит примесей высокомолекулярных белков (например, белков с молекулярным весом более 300000 дальтон) перед помещением в среду клеток. Такие белки удаляют из сыворотки, например, предфракционированием, к примеру, ультрафильтрованием.

Невозможность удаления белковых примесей с молекулярным весом более 300 К из сыворотки приводит к высокому содержанию белковых примесей на последующих этапах очистки, снижению выходов и чистоты.

Хотя в изобретении предфракционирование осуществляют проведением стадии ультрафильтрования, для специалиста, очевидно, что любой метод снижения содержания высокомолекулярных белковых примесей в сыворотке, добавляемой к среде, даст аналогичный результат.

Отделение частиц поверхностного антигена гепатита B от целых клеток, клеточных осколков и агрегатов частиц также может быть осуществлено любыми известными специалисту средствами, но рекомендуется проведение стадии ультрафильтрования. Полученный на стадии ультрафильтрования фильтрат, содержащий частицы HBsAg, затем собирают и подвергают дальнейшей очистке.

Поскольку объемы загрузок, используемых на стадии разделения (b), слишком громоздки, для их применения на рекомендуемых последующих стадиях очистки на хроматографических колонках, например, стадиях гель-хроматографии, частицы HBsAg могут быть подвергнуты дальнейшему концентрированию и дальнейшей очистке. Очистку рекомендуют осуществлять обработкой фильтрата, полученного после стадии разделения (b), на стадии ультрафильтрования с удалением загрязняющих примесей с молекулярным весом ниже 300 К. Отфильтрованный продукт, содержащий целевые частицы HBsAg, может быть затем подвергнут дальнейшей очистке. В рекомендуемом воплощении изобретения дальнейшую очистку осуществляют диализом, и после диализа для дальнейшей концентрации рекомендуют проводить еще одну стадию ультрафильтрования.

Концентрированные очищенные частицы HBsAg могут быть с помощью хроматографии, предпочтительно гель-фильтрующих колонок, подвергнуты дополнительной очистке с дальнейшим удалением загрязняющих низкомолекулярных веществ. Стадию гель-фильтрации для еще большей очистки рекомендуют проводить дважды. Хроматографию гель-фильтрацией рекомендуют проводить на колонке, заполненной аллилдекстраном, ковалентно сшитом N,N'-метиленбисакриламидом. На гель-фильтрующей колонке происходит удаление молекул с молекулярным весом выше 1·10 дальтон. Более подробно процесс описан в последующих примерах, в частности, в примере 5.

В особенно рекомендуемом способе изобретения очищенные концентрированные частицы поверхностного антигена гепатита B человека могут быть получены:
(a) культивированием клеток млекопитающего, продуцирующих частицы в культурную среду таким образом, что происходит секретирование клетками в среду частиц поверхностного антигена гепатита B человека, при этом в состав среды вводят сыворотку, не содержащую молекул с молекулярным весом более 3·10⁵ дальтон,
(b) удалением целых клеток, клеточных осколков и агрегатов частиц из полученной культурной среды, содержащей частицы поверхностного антигена гепатита B человека,
(c) обработкой полученной культурной среды с получением раствора, содержащего концентрированные частицы поверхностного антигена гепатита B человека,
(d) обработкой полученного раствора, содержащего концентрированные частицы антигена, с понижением в растворе содержания ДНК,
(e) регулированием pH в полученном в результате растворе, содержащем концентрированные и очищенные частицы поверхностного антигена, с установлением, если необходимо pH в пределах 3-7,
(f) очисткой очищенных концентрированных частиц поверхностного антигена, содержащихся в полученном растворе,
(g) выделением очищенных концентрированных частиц поверхностного антигена гепатита B человека.

Такой особенно рекомендуемый пример способ описан далее в примере II. В соответствии с таким особенно рекомендуемым способом раствор, содержащий выделенный на стадии (c) концентрированные частицы антигена, перед выделением подвергают дополнительной очистке. Стадии a, b, и c особенно рекомендуемого способа такие же, как и в способе, приведенном в примере 5, и вышеприведенное описание способа примера 5 также применимо к способу примера II. Дополнительный рекомендуемый способ описан в примере 13.

После обработки культурной среды с получением в результате раствора, содержащего концентрированные частицы поверхностного антигена гепатита B человека, полученный раствор обрабатывают с понижением в нем содержания ДНК. В одном рекомендуемом способе (пример II) обработка с уменьшением содержания ДНК заключается в добавлении к раствору ДНКазы. В другом рекомендуемом способе (пример 13) обработка с уменьшением содержания ДНК заключается в обработке раствора с помощью анионообменной хроматографии, предпочтительно на колонке, заполненной сшитой агарозой с присутствующими на ней диэтиламиноэтильными функциональными группами. Такая стадия анионообменной хроматографии может быть также проведена после обработки раствора ДНКазой.

Значение pH полученного в результате раствора, содержащего концентрированные и очищенные частицы поверхностного антигена, затем при необходимости регулируют с установлением pH в пределах 3-7. В одном из рекомендуемых воплощений изобретения pH устанавливают обработкой полученного раствора кислотой до появления помутнения. Муть содержит белковые примеси, которые могут быть удалены от частиц поверхностного антигена гепатита B, предпочтительно центрифугированием. Эта стадия представляет дополнительный этап очистки обработанных кислотой частиц антигена.

Или же ДНК и белковые примеси могут быть удалены из указанного раствора частиц антигена с помощью ионообменной хроматографии, предпочтительно анионообменной хроматографии, в которой частицы HBsAg элюируются с потоком через слой адсорбента, а ДНК и белковые примеси остаются связанными или удерживаются в колонке. В качестве анионообменной колонки рекомендуется использовать анионообменную колонку с ДЭАЭ. В особенно рекомендуемом воплощении изобретения анионообменная колонка, используемая для удаления ДНК и других примесей, заполнена агарозой с ДЭАЭ функциональными группами. Одним из примеров подобных колонок является колонка с ДЭАЭ-сефарозой. Данный способ более подробно освещен в примере 13.

Альтернатива заключается в сочетании обеих методик, т.е. уменьшения содержания ДНК в результате обработки ДНКазой и последующее подкисление, и затем удаление ДНК на ДЭАЭ-колонке.

Хотя для специалиста очевидно, что после удаления ДНК для дополнительной очистки может быть использован любой метод, например, катионо- или анионообменная хроматография, тем не менее рекомендуется сильная катионообменная хроматография, такая как хроматография на колонках с функциональными группами сульфокислоты. В особенно рекомендуемом воплощении изобретения применяемая для дальнейшей очистки катионообменная колонка заполнена сополимером N-акрилоил-2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиола с функциональными группами сульфокислоты следующего строения: -CONH-C(CH₃)₂-CH₂-SO₃H.

Одним из примеров такой колонки является SP-Трисакрил® 1S.

Высокочистые концентрированные частицы антигена перед дополнительным концентрированием, предпочтительно ультрафильтрованием, могут быть также обработаны формальдегидом с целью дезактивации каких-либо присутствующих живых организмов и вирусов. Полученные дополнительно концентрированные частицы затем очищают хроматографией, предпочтительно гель-фильтрующей хроматографией. Рекомендуемая колонка для гель-фильтрации заполнена аллилдекстраном, ковалентно сшитым N,N'-метиленбисакриламидом.

Как показано в примере 10, применение стадий, альтернативных рекомендуемым, создает много проблем. Так, например, при использовании для разделения вместо ультрафильтрования центрифугирования основные клеточные примеси, такие как клеточные мембраны и липидные комплексы, не удаляются, что приводит к снижению общего выхода и уменьшению чистоты частиц HBsAg. Кроме того, центрифугирование дорого и длительно. Применение системы стерилизация с мембраной в 0,22 мк приводит к другим трудностям, описанным в примерах.

Аналогично при использовании для концентрирования ПЭГ вместо ультрафильтрования, как найдено, достигают только 75%-ного выделения частиц HBsAg. Кроме того, чистота уменьшается, и процесс требует больших затрат времени.

Соответственно, хотя альтернативные методы типа описанных в примере 10 и методы, известные специалистам, и могут быть использованы, тем не менее в примере 5 обсуждаются рекомендуемые для каждого этапа стадии. Кроме того, как указано выше, особенно рекомендуемое воплощение изобретения детализировано в примере II.

Могут быть использованы любые клетки млекопитающего, способные экспрессировать к ДНК, кодирующую поверхностный антиген гепатита В. Рекомендуются клетки яичника китайского хомячка (CHO), особенно клетки CHO-HX200.

Поверхностный антиген гепатита В получают культивированием клеток млекопитающего, например, клеток CHO-HS200. Условия культивирования специалистам известны. Культивирование может быть проведено в бутылях с перемешиваемым при их вращении содержимым или в ферменторах с использованием микроносителей.

Осуществлением способа выделяют очищенные частицы поверхностного антигена гепатита В. Как показано выше, такие очищенные частицы содержат пред- S1, пред- S2 и S полипептиды поверхностного антигена гепатита В и уровень чистоты частиц может достигать от 95% до 98-99% (от 95% до 98-99% без белковых примесей). Очищенные частицы поверхностного антигена гепатита В, кроме того, содержат пред- S1, пред-S2 и S полипептиды поверхностного антигена в стехиометрических количествах, приближающихся к тем же количествам в частицах из плазмы.

Более конкретно, очищенные частицы поверхностного антигена гепатита В могут содержать полипептиды поверхностного антигена в следующих количествах: полипептид поверхностного антигена составляет 75-80% частицы, пред- S2 полипептид 10-15% частиц и пред- S1 полипептид 5-10% частицы. В одном конкретном воплощении изобретения S полипептид поверхностного антигена составляет 78% частицы, пред- S2 полипептид 14% частицы и пред- S 1-8% частицы.

В более специфичном воплощении изобретения изобретением даются очищенные частицы поверхностного антигена гепатита В, в которых полипептиды поверхностного антигена могут быть найдены в следующих количествах,
S 24 кД негликозилирован 62,4
S 27 кД гликозилирован 15,6
Пред- S2 33 кД моногликозилирован 10,8
Пред- S2 36 кД дигликозилирован 3,2
Пред- S1 39 кД негликозилирован 6,1
Пред- S1 41 кД гликозилирован 1,9
Для специалиста очевидно, что количества, приведенные выше, могут меняться в зависимости от чистоты выделенного продукта.

Изобретением также дается вакцина поверхностного антигена гепатита В, содержащая эффективное иммунизирующее количество частиц поверхностного антигена гепатита В, полученных вышеприведенным способом, и приемлемый носитель.

Нижеследующие примеры даются с целью пояснить изобретение, но не предназначены и их не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения. Примеры не содержат подробных описаний обычных методик, применяемых для конструирования векторов, вставки генов, кодирующих полипептиды, в такие вектора или введения полученных плазмид хозяину. Примеры также не содержит подробных описаний обычных методик, применяемых для анализа полипептидов, образуемых в таких системах хозяин-вектор. Кроме того, они не содержат подробных описаний обычных методик культивирования тканей млекопитающего, а также методик трансформаций клеточной культуры тканей рекомбинантной ДНК. И, наконец, примеры не содержат подробных описаний обычных методик ультрафильтрования и гель-фильтрации для очистки полипептидов, продуцируемых трансформированной клеточной культурой тканей.

Такие методы хорошо известны специалистам и описаны в многочисленных публикациях, например, следующих:
Общие методы молекулярной биологии: Maniatis и др. "Молекулярное клонирование. Лабораторный справочник", Коулд Спринг Харбор Лэборетори, Нью-Йорк (1982), Davis и др. "Фундаментальные методы молекулярной биологии", Эльзевир, Нью-Йорк, Амстердам (1986).

Методы культивирования тканей млекопитающих: Uslaub и Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. 77, 4216-4220 (1980), Pellicer и др. Science 209, 1414-1422 (1980), Laub и др. J. Virol. 48, 241-280 (1983), Petzer и др. в кн. "Вирусный гепатит и заболевания печени", Vyas (ред.), стр. 477-485, Грюн энд Страттон, Орландо, Флорида (1984), Michel и др. Bio/Technology 3, 561-566 (1985).

Методы ультрафильтрования: Trudel и др. Process Biochem 18, 2-9(1983).

Методы гель-фильтрации: Fischer в кн. "Гель-фильтрационная хроматография", Эльзевир, Амстердам (1980).

Клеточные линии млекопитающих. Заявителем использованы клеточные линии, обозначенные как CHO^200mr p7. 5AL26 и CHO^50mrp7.5AL26, созданные в институте Вейзманна /Йеда Резерч энд Дивилопмент Компени и депонированные в Пастеровском институте под N 1-574 и 1-575, соответственно. Конструирование этих плазмид описано в находящихся на рассмотрении заявках на европейские патенты. Для осуществления изобретения могут быть также использованы и другие клеточные линии, содержащие область HBsAg гена на поддающейся выбору трансформирующей плазмиде.

Пример 1. Клеточные линии и плазмиды, созданные и использованные в изобретении.

Для получения и очистки частиц HBsAg заявителем использована клеточная линия CHO, а именно CHO^mr200p7.5AL26 (фиг. 1). Однако найдено, что эта клеточная линия загрязнена микоплазмой, что вызывало необходимость ее облагораживания перед употреблением.

Такую клеточную линию конструируют путем транфекции клеток CHdhfr ДНК из плазмиды p7.5AL26 и ДНК из плазмиды, содержащей ген dhfr. Отношение p7.5AL26 ДНК к плазмидной ДНК, содержащей ген dhfr, 10:1.

Плазмиду p7.5AL126 конструируют путем вставки в Ecorl сайт pBR322 фрагмента EcoRl в 7,5 Кв, содержащего полный интегрированный ген поверхностного антигена ВГВ, включая пред- S1 и пред- S2 области, а также промоторы ВГВ, обозначенные как "ТАТА"-промотор и "SV40 подобный" промотор. Кроме того, этот фрагмент содержит ВГВ усиливающий элемент и 2-3 сайты полиаденилирования в нисходящем направлении от 3'- конца. ДНК выделена Shaul и др. J. Virol 51, 776-787 (1984) из клеток Александера и содержит фланкирующие ДНК последовательности хозяина (клеток Александера) в 5'- и 3'- конце ДНК ВГВ. Так, например, фрагмент Pst ДНК в 3,8 Кв из p7,5A126 вводят в pSP64. Полученная плазмида (pS PHBV8-1) содержит 100 п.о. из ДНК человека в восходящем направлении в ВГВ промоторе рамке ТАТА (рамка Хогнесса) и 600 п.о. ДНК человека вне P_I области в нисходящем направлении от 3'- конца гена.

A. Облагораживание клеточной линии CHO^200mrp7,5A126. Клеточную линию CHO^200mrp7.5A126, загрязненную микоплазмой, облагораживают с помощью набора антибиотиков ВМ-ЦИКЛИН^TM (Боэрингер, Манхайм). Облагораживание проводят точно в соответствии с инструкцией, прилагаемой к набору (каталожный N 799050 фирмы Боэрингер Манхайм, который используется здесь в качестве ссылки). Облагораживание проходит успешно с получением клеточной линии, обозначенной как CHO-HB200, не содержащей микоплазмы и продуцирующей частицы HBsAg на высоком уровне.

B. Уровень продуцирования HBsAg в облагороженной клеточной линии CHO^200mrp7.5AL26(CHO-HB200). Конститутивную экспрессию иммунореакционноспособных HBsAg указанной клеточной линией вначале определяют анализом среды слитных культур. С помощью набора для твердофазного радиоиммуноанализа Травенол® для обнаружения HBsAg выявлено, что среда слитных CHO-HB200 культур содержит 3-5 мг/л иммунореакционноспособных HBsAg.

C. Стабильность облагороженного CHO^mr200p7.5AL26 клона-CHO-HB200. Отобранный клон CHO-HB200 стабильно продуцирует HBsAg в течение по меньшей мере 6 месяцев.

D. Создание новых плазмид экспрессии HBsAg. Плазмиду pSPHBV8-1 (фиг. 1) подвергают дальнейшим превращениям с делецией оставшихся в восходящем направлении ДНК-последовательностей клеток Александера. Делецию осуществляют субклонированием фрагмента Xbal EcoR1 в 500 п.о. и фрагмента EcoR1-Ps tl в 240 п.о. из pSPHBV8-1 в psP65 с получением pSPHBVB8 (фиг. 2).

Ген dhfr под контролем раннего промотора SV40 и сайта полиаденилирования SV40 субклонируют в pSPHBV8-1 и pSPHBVB8 с получением соответственно pSPHBVA13 и pSPHBVB813 (фиг. 3). Для получения плазмид проводят субклонирование в Pvull сайт приемлемой плазмиды ВГВ наполненного фрагмента EcoRl-Sma1 в 1300 п. о. из pSVE100-dhfr, содержащего dhfr ген со всеми регулирующими последовательностями.

Укороченные конструкты, содержащие ген HBsAg под контролем его естественного промотора, а также dhfr ген под контролем SV40 раннего промотора, трансфектируют в клетки dhfr-CHO.

Пример 2. Методы культивирования тканей.

Нижеследующие методики, использованные в изобретении, как правило, являются стандартными методиками, применяемыми в культивировании тканей из клеток млекопитающих. Видоизменения подобных методов описаны и могут быть также использованы для тех же целей (примеры этих методик, включая и наши, см. в следующих ссылках: Uslaub и Chasin, Pros. Natl. Acad. Sci 77, 4216-4220 (1980), Pellicer и др. Science 209, 1414-1422 (1980), Laub и др. J. Virol 48, 271-280 (1983), Petzer и др. в кн. "Вирусный гепатит и заболевания печени". Vyas и др. (ред.) стр. 477-485), Грюн энд Страттон Инк. Орландо, Флорида (1984), Michel и др. Bio-Technology 3, 561-566 (1985)).

A1. Трипсинизация. Объединенные культуры перед субкультивированием или консервирования в замороженном состоянии подвергают трипсинизации. Культурную среду /модифицированная минимальная среда Игла фирмы Дульбеккоу (DMEM)/ отбрасывают из сосуда для культивирования и в него добавляют холодный раствор трипсина (0,25% разбавление 1:3) в ФБР. (Объем добавляемого трипсина составляет 1/10 от объема начальной ростовой среды). Содержащиеся в сосуде клетки быстро промывают и избыток трипсина удаляют. После выдерживания при 37^oC в течение 5-10 мин, в ходе которых остатки трипсина контактируют с клетками, в сосуд для культивирования для прекращения трипсинизации добавляют ростовую среду (DMEM), содержащую 5-10% плодной сыворотки теленка (ПСТ). Остoрожным встряхиванием клетки отделяют от стенок сосуда и суспендируют в среде. Полученные клетки либо субкультивируют, либо замораживают для долговременного хранения.

Получение раствора трипсина, 0,25% (исходного). Раствор трипсина содержит, г:
NaCl 80
KCl 4
Декстроза 10
NaHCO₃ 3,5
Трипсин (1:300 ICN) 25
Все вышеперечисленные компоненты растворяют в 10 л воды, после чего устанавливают pH 8,5.

Полученный раствор затем фильтруют через фильтр (0,22 мк), замораживают (-20^oC), после чего может храниться многие годы.

A2. Получение рабочего раствора трипсина (разбавление 1:3).

Исходный раствор разбавляют (1:3) раствором того же состава, что и исходный раствор (см. выше), но без трипсина.

B. Долгосрочное хранение клеток. В случае необходимости хранить клетки долгое время осуществляют следующую процедуру. Объединенные культуры трипсинизируют по методике раздела 1. Суспендированные клетки промывают один или два раза средой DMEM, содержащей 10% ПСТ. После промывания клетки вновь суспендируют в среде, содержащей 20% ПСТ + 10% ДМСО с достижением конечной концентрации клеток 3-4·10⁶ клеток/мл. Сосуды выдерживают 1 ч при комнатной температуре, после чего переносят в морозильник (-20^oC). На следующее утро замороженные сосуды выдерживают при -70^oC еще 24 ч. Наконец, сосуды помещают в жидкий азот для долгосрочного хранения.

Примерно через неделю 1-3 сосуда размораживают для определения жизнеспособности клеток. Этим путем создают банки эталонных и рабочих клеток.

C. Размораживание хранимых клеток. Сосуд с хранимыми замороженными клетками быстро извлекают из резервуара для хранения с жидким азотом и помещают в водяную баню (37^oC). Клетки быстро оттаивают и переносят в Т-сосуд (75-150 мл), содержащий DMEM с 10% ПСТ. Через несколько часов видно, как большая часть клеток прикрепляется ко дну сосуда. Среду пополняют через 4 ч после размораживания клеток. Примерно через 5-8 дней культура достигает слитности.

Пример 3. Система культивирования клеток в бутылях с перемешиваемым содержимым.

A. Ростовая среда. Все клеточные линии СНО выращивают в модифицированной среде Игла фирмы Дульбекко (DMEM), содержащей 10 мМ глутамина (Гибко), 20 мМ гепеса (Рот Лтд. ), 30 мМ NaHCO₃ (Мерк), 150 мкг/мл пролина (Сигма) и 40 мкг/мл Гентамицина (Сигма). Для обеспечения потребностей культивирования в среду вводят 2-10% плодной сыворотки теленка (ПСТ) (Бокнек). Оптимальное рабочее значение pH среды в интервале 7,15-7,25.

B. Инокуляция и проведение культивирования. Для выращивания клеток и продуцирования HBsAg используют пластиковые бутыли с перемешиваемым содержимым на 850 см³ или 490 см³ (Корнинг). Слитные культуры трипсинизируют и клетки суспендируют в среде DMEM, содержащей 10% ПСТ, и затем используют для рекультивирования. Каждую бутыль инокулируют 50-100 мл среды, содержащей 10% ПСТ и по меньшей мере 5·10⁶ клеток. Размер инокулума определяет период времени, необходимого для достижения слитности культуры вновь (обычно 2-10 дней). Через несколько часов после инокуляции большая часть клеток закрепляется и начинает разрастаться. Через 24 ч можно наблюдать деление клеток.

Рекомендуется использовать среду, содержащую 10% ПСТ, до момента достижения слитности среды, и на этом этапе содержание ПСТ понижают до 2-5% Сниженное содержание ПСТ оптимально для долговременного поддерживания клеток и продуцирования. Такие культуры могут поддерживаться до 6 месяцев без утери ими способности продуцировать HBsAg.

Число клеток в слитых культурах колеблется в пределах 2·10⁸-10⁹ клеток на бутыль.

Интенсивный метаболиз, характерный для СНО клеток, в сочетании с высокой плотностью клеток приводит к быстрому падению pH в среде. За этим, вероятно, следует, с одной стороны, обеднение среды и выделение нежелательных токсичных метаболитов, с другой стороны. Во избежание потенциального урона клеткам рекомендуется ежедневно пополнять среду слитными культурами.

Пример 4. Система продуцирования HBsAg в бутылях с перемешиваемым содержимым.

Для непрерывного долговременного продуцирования HBsAg применяют конструктивное продуцирование HBsAg клетками СНО-НВ200 (пример 1). Продуцирование HBsAg в слитных культурах с ежедневным пополнением моносредой устойчиво в течение по меньшей мере 6 месяцев. Скорость продуцирования составляет 4-5 мг/л/24 ч, и она не меняется в течение 6 месяцев непрерывного культивирования.

Хотя в системе культивирования в бутылях с перемешиваемым содержимым можно получить большие количества HBsAg, тем не менее такой метод приемлем лишь для ограниченного промышленного производства. Основные ограничения создаются величиной вкладываемого труда и неэффективностью технологии.

Таким образом, системы бутылей с перемешиваемым содержимым рекомендуются для выращивания клеток, используемых для инокуляции широкомасштабных систем продуцирования, таких как прядильные машины и ферментаторы с применением микроносителей.

Пример 5. Рекомендуемый способ A для продуцирования и очистки частиц HBsAg.

Как указано в заглавии примера, излагаемый ниже способ относится лишь к одному из рекомендуемых способов. Более предпочтительный способ отражен в примере 11, и он является особенно рекомендуемым. Ниже приведены технологические схемы I и II обоих способов соответственно.

Схема I получения и очистки частиц HBsAq:
Стадия 1. Получение частиц HBsAg в системе тканевой культуры использованием культурной среды с добавкой ПСТ, предфаркционированной на отсечной мембране Пелликон^ТМ на МВ 300000; к клеточной культуре добавляют только фильтрат (белки с МВ<300000), удержанный на мембране продукт (белки с МВ>300000) отбрасывают.

Стадия 2. Ежедневный сбор культурной среды, объединение и очистка вначале ответвлением культурной среды, содержащей частицы HBsAg, на мембране Пелликон^ТМ на 0,22 мк; далее очищают только фильтрат, удержанный на мембране продукт (клетки и клеточные осколки) отбрасывают.

Стадия 3. Концентрирование частиц HBsAg из осветленной сырой среды (фильтрат со стадии 2) и диализ в ФБР на отсечной мембране Пелликон^ТМ на МВ 300000; далее очищают только удержанный продукт (белки с МВ более 300000), фильтрат отбрасывают (белки с МВ ниже 300000), удержанный продукт концентрируют дополнительно на отсечной мембране Минитен ^ТМ на МВ 300000.

Стадия 4. Удержанный продукт стадии 3 очищают гель-фильтрацией 1 на колонке Сефакрила S-400^ТМ, затем элюируемые пиковые фракции HBsAg концентрируют на отсечной мембране Минитен^ТМ на МВ 300000.

Стадия 5. Концентрированный элюат стадии 4 дополнительно очищают гель-фильтрацией 11 на колонке Сефакрила S-400^ТМ затем элюированные пиковые фракции HBsAg концентрируют на отсечной мембране Минитен^ТМ на МВ 300000.

Схема II. Особенно рекомендуемый способ получения и очистки частиц HBsAg (рекомендуемый способ B):
Стадия 1-3. Как на схеме I.

Стадия 4. Обработка ДНКазой частиц HBsAg из концентрированной осветленной культурной среды. Разбавление и подкисление 20 мМ NaAc (pH 4,5). Возникающую муть удаляют центрифугированием.

Стадия 5. Жидкую часть со стадии 4 очищают на колонке SP-Трисакрил^ТМ LS.

Стадия 5а. Концентрированный элюат со стадии 5 обрабатывают формальдегидом.

Стадия 6. HBsAg содержащий раствор со стадии 5 концентрируют на отсечных мембранах Минитен^ТМ или Пелликон^ТМ на МВ 100000. Концентрированный удержанный продукт очищают на Сефакриле-400. Элюат с колонки Сефакрила-400 стерилизуют фильтрованием через фильтр на 0,2 мк.

А. Краткое описание способа.

Для продуцирования HBsAg использована система бутылей с перемешиваемым содержимым (примеры 3, 4). Применяемая среда содержит 2-10% ПСТ, предпочтительно 2% ПСТ, подвергнутой предфракционированию ультрафильтрованием в системе Пелликон® (ультрафильтрование с тангенциальным потоком Пелликон®, Mиллипор® с отсечной мембраной на МВ 300000 с удалением высокомолекулярных белковых примесей (стадия 1).

Культурную среду собирают и объединяют (сбор). Собранную среду, содержащую частицы HBsAg, осветляют с помощью ультрафильтрования с тангенциальным потоком системы Пелликон®(Миллипор®) с мембраной на 0,22 мк, на которой удаляют клетки и крупные клеточные осколки (стадия 2). Затем осветленную сырую среду концентрируют и диализуют (с ФБР) ультрафильтрованием с тангенциальным потоком системы Пелликон®(Миллипор®) с отсечкой мембраной на МВ 300000 (стадия 3). Концентрат подвергают дальнейшей очистке в двух последовательных гель-фильтрационных хроматографических опытах на колонке Сефакрила S-400® (2,6 x 190 см) (Фармация®). После каждого опыта пиковые фракции, содержащие частицы HBsAg, концентрируют с помощью ультрафильтрования в системе Минитен® с тангенциальным потоком Миллипор® с отсекающей мембраной на МВ 300000. Процедура очистки обобщена на схеме 1. Результаты при использовании такой новой методики очистки частиц HBsAg, приведены в примере 6, в котором описано приготовление партии в 100 мг высокочистых частиц HBsAg.

Методики, используемые на стадиях ультрафильтрования с тангенциальным потоком в системах Пелликон® и Минитен® соответствуют инструкции, прилагаемой изготовителем (Миллипор Корп). Методика гель-фильтрации на колонке Сефакрил S-400® с объемом слоя 1 л соответствует инструкции, предлагаемой изготовителем (Фармация Файн Кемиклз). Во всем процессе очистки заявитель пользовался только фосфатным буферным солевым раствором (ФБР) в качестве буфера для ультрафильтрования, диализа и гель-фильтрационной хроматографии (загрузка и элюирование). Заявитель пользовался буфером ФБР, не содержащим кальция (Ca⁺⁺) И магния (Mg⁺⁺).

B. Не содержащий Ca⁺⁺Mg⁺⁺ буфер ФБР. Не содержащий Ca⁺⁺ и Mg⁺⁺ буфер ФБР (x 1) получают следующим образом, г:
NaCl 8
KCl 0,2
Na₂HPO₄ 1,15
KH₂PO₄ 0,2
Перечисленные компоненты растворяют в 1 л H₂O (дистиллят, без пирогенов) и в полученном растворе устанавливают pH 7,25.

C. Подробное описание нового способа получения очистки HBsAg.

Стадия 1. Предфракционирование клеточной культурной среды
Клетки CHO-HB200, продуцирующие и секретирующие в культурную среду частички HBsAg (пример 1) выращивают в системе культивирования в бутылях с перемешиваемым содержимым (примеры 3 и 4). Заявитель для выращивания обычно использовал 20 таких бутылей.

В культурную среду добавляют ПСТ следующим путем. Для инокуляции культурной среды в бутылях с перемешиваемым содержимым применяют добавку в 10% ПСТ. Для ежедневного пополнения культурной среды (заменой однодневной среды свежей средой) в культурную среду добавляют 2-5% ПСТ, предпочтительно 2% В обоих вышеприведенных случаях культурную среду с добавкой ПСТ вначале предфракционируют ультрафильтрованием с тангенциальным потоком в системе Пелликон® с отсечной мембраной на МВ 300000. Давление на входном и выходном манометрах обычно в пределах O psi (O ат). К клеткам добавляют только фильтрат (среду с добавкой ПСТ с компонентами МВ ниже 300000).

Для инокуляции содержимого бутылей в каждую бутыль вносят 100 мл предфракционированной среды с добавкой 10% ПСТ, содержащей по меньшей мере 5·10⁶ клеток CHO-HB200. Клетки выращивают в этой среде до момента достижения ими слитности (2-10 дней).

После достижения клетками слитности (2·10⁸-1·10⁹ клеток на бутыль с перемешиваемым содержимым) начинают очистку частиц HBsAg, продуцированных клетками. Инокулирующую среду с добавкой 10% ПСТ удаляют из клеточной среды и отбрасывают. Ее заменяют предфракционированной средой с добавкой 2% ПСТ. Клетки выращивают в такой среде в течение по меньшей мере 6 месяцев с ежедневной заменой среды. Слитные клетки продуцируют 4-5 мг частиц HBsAg на 1 л (10 бутылей) в день. Культурную среду из бутылей отбирают ежедневно (20 х 100 мл 2 л в день), и она содержит секретированные частицы HBsAg. Собранную среду объединяют и хранят при 4^oC. После накопления 25 л собираемой ежедневно и объединяемой слитной культурной среды (80-100 мг HBsAg, 13 дней культивирования) начинают очистку частиц HBsAg из объединенной среды периодическим способом по методике стадии 2.

Уникальная стадия предфракционирования культурной среды с добавкой ПСТ, приведенная выше, позволяет заявителю получать частицы HBsAg высокой степени чистоты с использованием наименьших стадий очистки. Основания для такого заявления могут быть суммированы следующим образом.

Основными загрязняющими примесями в культурной среде, содержащей секретированные частицы HBsAg, являются изначально присутствующие в ПСТ белки. ПСТ необходима для достижения наилучших условий культивирования, вследствие чего ее невозможно исключить из клеточной культуры. Секретированные частицы HBsAg обладают большим молекулярным весом, поэтому белки, загрязняющие в ходе очистки фракцию HBsAg, также будут иметь большой молекулярный вес. С помощью вышеописанной стадии предфракционирования на мембране, отсекающей вещества MB выше 300000, заявитель удаляет из культурной среды большую часть высокомолекулярных белковых примесей. В результате заявитель добавляет в культурную среду только те компоненты содержащей ПСТ среды, молекулярный вес которых ниже 300000. Таким образом исключает из клеточной культуры высокомолекулярные белковые комплексы, такие как комплексы антител и агрегаты полиальбумина. В самом деле, сравнивая показатели роста и продуцирования HBsAg клеток в предфракционированной среде с показателями для клеток, выращенных в непредфракционированной среде, замечено, что первая превосходит вторую по обоим позициям, т.е. предфракционированная среда дает два основных преимущества: лучший рост клеток и пониженное содержание примесей при очистке HBsAg.

И, наконец, на последующих этапах очистки в основном необходимо отделить высокомолекулярные частицы HBsAg от низкомолекулярных белков примесей. Такие примечи включают в качестве основной фракции альбумин из ПСТ с молекулярным весом около 97000 дальтон.

Стадия 2. Осветление собранной культурной среды, содержащей частицы HBsAg.

Данная стадия на деле является первой стадией процесса очистки HBsAg, на которой диссоциированные целые клетки и клеточные осколки, присутствующие в собранной среде (содержащей HBsAg), удаляют из среды. Этот процесс обычно называют осветлением сырой культурной среды. Для осветления содержащей HBsAg среды заявителем использована система ультрафильтрования Пелликон® с тангенциальным потоком и фильтром на 0,22 мк. Обычно в такой системе за раз отфильтровывают партию в 25 л (80-100 мг частиц HBsAg). Показания маномеров на входе и выходе соответствуют O psi (O ат). В такой системе могут быть обработаны и более крупные партии или большее число партий, т.к. такая система способна профильтровывать сотни литров среды в 1 ч. После фильтрования каждой партии систему промывают 5-10 л ФБР. Таким образом, это очень быстрый процесс, который может быть использован в промышленных масштабах.

Фильтром на 0,22 мк (220 нм) задерживаются только целые клетки агрегаты клеточных осколков (>220 нм) например, мембраны и мембранные комплексы, большие клеточные органеллы. На данной стадии осветления ультрафильтрованием собирают только фильтрат (содержащий 22 нм частицы HBsAg), который подвергают дальнейшей очистке на стадиях 3-5. Объем фильтрата равен исходному объему, а именно, 25 л на партию. Никаких потерь (выход 100%) ни в частицах HBsAg, ни в общем белке культурной среды на данной стадии осветления ультрафильтрованием не происходит.

Стадия 3. Концентрирование и очистка частиц HBsAg из осветленной культурной среды.

Объем осветленной сырой культурной среды (стадия 2) тот же, что и перед осветлением, а именно, 25 л на партию. Для специфичной очистки частиц HBsAg от такой культурной среды необходимо вначале провести стадию концентрирования. Объемы загрузок, такие большие, как у заявителя, не могут быть использованы непосредственно на очистных гельфильтрующих колонках конечных стадий (стадии 4, 5). Таким образом, необходима стадия концентрирования, а также стадия концентрирования, на которой происходит специфичная очистка частиц HBsAg от остальных компонентов культурной среды. Такую стадию осуществляют концентрированием осветленной сырой культурной среды в системе ультрафильтрования Пелликон® с тангенциальным потоком и отсечной мембраной на MB 300000. Такая система также позволила заявителю провести в замкнутой системе ультрафильтрования диализ частиц HBsAg, удерживаемых мембраной на MB 300000.

Заявитель в систему Пелликон® с фильтром на MB 300000 (см. выше) вводит 25 л осветленной сырой среды и фильтрат отбрасывают (содержит альбумин с молекулярным весом ниже 300000). Оставшийся на фильтре продукт (включает частицы HBsAg с молекулярным весом выше 300000) диализуют в 10 л ФБР (10 х 1 л). После диализа объем удержанного на фильтре продукта составляет 660 мл, что соответствует примерно 40-кратному концентрированию.

600 мл концентрата (или удержанного на фильтре продукта) собирают и подвергают дальнейшему концентрированию в системе ультрафильтрования Минитен® с тангенциальным потоком и отсечной мембраной на MB 300000. Система Минитен® более пригодна для небольших объемов (до 1 л), чем система Пелликон® Фильтрат от фильтрования в системе Минитен® отбрасывают, а собирают только удержанный на фильтре продукт. Обычно в системе Минитен® получают около 150 мл удержанного продукта (или концентрата) при загрузке около 660 мл удержанного продукта (или концентрата) из системы Пелликон® Это соответствует примерно 4-5-кратному дальнейшему концентрированию. Таким образом, использование последовательно систем Пелликон® и Минитен® достигают общего концентрирования осветленной сырой среды примерно в 180 раз.

Вышеописанная система не только концентрирует осветленную культурную среду, но также специфично очищают частицы HBsAg от компонентов среды. После концентрирования в вышеописанной системе с отсечной мембраной на МБ 300000 извлекается всего 2,5% общего белка осветленной культурной среды. И в то время извлекается 95% всех частиц HBsAg культурной среды, т.е. достигается специфичная очистка частиц HBsAg от содержащихся в культурной среде примесей (примерно в 35 раз). Хотя удается выделить 95% начальных частиц HBsAg, эти частицы составляют только часть от 2,5% выделенного исходного общего белка, Так как в общем количестве белка (636 мг) содержится 95 мг HBsAg (около 15% ). Полученный концентрат (удержанный в системе Минитен® Продукт) в количестве 150 мл подвергают дальнейшей очистке гель-фильтрацией с достижением окончательной очистки частиц HBsAg (стадии 4, 5).

Стадия 4. Очистка гель-фильтрацией частиц HBsAg из концентрированной осветленной культурной среды.

Для дальнейшей очистки частиц HBsAg использованы их физико-химические свойства, а именно, их эффективный молекулярный вес, находящийся в интервале 1-2·10⁶ дальтон. По этой причине использована гель-фильтрационная колонка, заполненная Сефакрилом S 400®(Фармация®), отсекающая молекулы с молекулярным весом более 1·10⁶ дальтон. Гель-фильтрационная колонка заполнена Сефакрилом S-400® или аллилдекстраном, ковалентно сшитым N,N' - метиленбисакриламидом. На колонке крупные молекулы, такие как частицы HBsAg, отсекаются и быстро элюируются. Молекулы примесей с меньшим размером, такие как альбумин и другие белки, проникают в смолу колонки и элюируют медленно, что приводит к эффективному разделению частиц HBsAg и низкомолекулярных примесей. Используемая заявителем колонка Сефакрила S-400® имеет размеры 2,6 х 190 см при эффективном объеме колонки 1 л. При больших объемах концентрата или при больших количествах белка в концентрате могут быть использованы колонки Сефакрила S-400® большей производительности.

Концентрированная культурная среда типичной партии заявителя имеет объем около 150 мл (стадии (3) и содержит примерно 95 мг частиц HBsAg из общего количества белка в 640 мг. В результате этапа диализа в ходе концентрирования (стадия 3) концентрат представляет собой, таким образом, раствор ФБР, содержащий частицы HBsAg в 150 мл ФБР). Для каждой партии концентрата заявителем использована лишь одна колонка Сефакрила S-400®, хотя для ускорения очистки может быть использовано и большее число колонок.

Заявитель загружает примерно треть (около 32 мг HBsAg в 50 мл ФБР) концентрата на разовую гель-фракцию через колонку. Это составляет около 5% (по объему) от объема слоя колонки. Для лучшего разделения скорость потока устанавливают около 10 см в 1 ч, в результате чего создается низкое рабочее давление в 25-30 см H₂O.

Элюирование частиц HBsAg с колонки осуществляют использованием ФБР в количестве до одного слоя колонки (1 л). После элюирования и перед использованием той же колонки ее промывают 2-3 объемами слоя (2-3 л) ФБР.

Из-за большого размера частицы HBsAg не проникают в слой смолы в колонке, вследствие чего быстро элюируются из колонки. Пик частиц HBsAg выделяют из фракций, следующих непосредственно за холостым объемом. Объем элюируемых фракций обычно 10 мл. Элюирование частиц HBsAg устойчиво а 14-15 фракциях (140-150 мл).

Скорость выделения частиц HBsAg с колонки Сефакрила S-400® очень высока, и степень очистки значительна. После пропускания через одну колонку частота частиц HBsAg возрастает в 4-5 раз, так чистота HBsAg специфичного компонента всего белкового продукта в элюируемой пиковой фракции HBsAg составляет 60-70% (повышение всего лишь с 15% во всем предколоночном концентрате). Из 32 мг HBsAg, загружаемых в 50 мл ФБР, выделяют 30 мг HBsAg в 140 мл элюата, выход 92% Для дальнейшей очистки частиц HBsAg выше 95% проводят гель-фракцию через вторую колонку с тем же Сефакрилом S-400® (стадия 5).

Стадия 5. Повторная очистка гель-фильтрацией частиц HBsAq их элюированного пика с первой гель-фильтрационной колонки.

Для повторной гель-фильтрации используют ту же самую, что и в первой гель-фракции (стадия 4), колонку Сефакрила S-400® После первой гель-фильтрации колонку промывают 3-5 объемами слоя (3-5 л) ФБР с удалением всех связанных молекул. Каждая типичная партия концентрированной осветленной культурной среды требует 3-4 прогона через первую колонку, каждый прогон составляет 1/3 объема концентрата. Для повторной гель-фильтрации пиковые фракции двух первых прогонов гель-фильтрации объединяют (140-150 мл каждый). Таким образом, обычно 280-300 объединенных элюированных пиковых фракций части HBsAg сначала концентрируют и затем загружают на колонку Сефакрила S-400® для повторной гель-фильтрации. Третий элюируемый пик HBsAg первой гель-фильтрации объединяют. Таким образом, с таким же пиком следующей партии для повторной гель-фильтрации для каждых двух партий концентрированной культурной среды, содержащей частицы HBsAg, при первой гель-фильтрации необходимо 6 прогонов и 3 прогона при повторной гель-фильтрации).

Для концентрирования объединенных пиковых фракций перед загрузкой во вторую гель-фильтрационную колонку используют систему Минитен® с тангенциальным потоком и отсечной мембраной из MB 300000 (описание см. стадию 3). В результате объем понижается с 280-300 мл до 60 мл (5-кратное концентрирование). Эти 60 мл содержат 57-60 мг HBsAg частиц и их загружают в колонку Сефакрила S-400® для повторной гель-фильтрации.

Пиковые фракции частиц HBsAg, элюирумеые (с ФБР) с повторной гель-фракции, содержат около 48,5 мг частиц HBsAg в 140 мл ФБР, что составляет выход в 85% для частиц HBsAg. Кроме того, такая вторая пиковая фракция гель-фильтрации содержит специфичный белок HBsAg чистотой более 95% (98-99%).

Таким образом, применением двух последовательных гель-фильтрационных колонок для очистки частиц HBsAg из концентрированной сырой среды заявитель добивается очень высокого выхода (78%) при очень высокой частоте (более 95% ).

В ходе всего процесса очистки скорости выделения, выхода и чистоту частиц HBsAg на каждой стадии определяют с помощью методов анализа, описанных в примерах 7, 8 и 9.

Процесс очистки отражен на схеме I, а получение и очистка типичной партии частиц HBsAg приведены в примере 6.

В описываемом здесь процессе очистки стадии 1-6 могут быть переведены в промышленный масштаб с получением частиц HBsAg, предназначенных для вакцин. Такой перевод осуществляют:
выращиванием культуры в большем количестве бутылей с перемешиваемым содержимым или в ферментаторах с микроносителем,
ультрафильтрованием с помощью систем Пелликон® или Минитен® или их эквивалентов, приспособленных для промышленных объмов (Миллипор® Корп),
очисткой гель-фильтрацией на колонке Сефакрила S-400® с большим объмом слоя или на большем числе описанных колонок (стадии 4, 5), соединенных последовательно.

В итоге некоторые отдельные признаки способа получения и очистки могут быть суммированы следующим образом.

Предфракционированием культурной среды удаляются создающие проблемы высокомолекулярные белковые примеси, что позволяет заявителю очищать частицы HBsAg гораздо более простым путем. Стадия концентрирования перед очисткой в высшей степени эффективна, и сопровождается значительной предварительной очисткой. Стадии очистки протекают быстро в системе, которая может быть использована повторно.

Все элементы, составляющие стадии осветления, концентрирования и очистки (стадии 2-5), могут быть соединены вместе (трубопроводом) с образованием замкнутой системы.

Таким образом, заявитель может получать в больших количествах методами биотехнологии частицы HBsAg с высокой эффективностью и при очень низкой стоимости.

Пример 6. Получение и очистка 100 мг HBsAg (первая партия).

Приводимые ниже методики получения и очистки частиц HBsAg более подробно описаны в примере 5.

Для получения HBsAg используют 20 бутылей с перемешиваемым вращением содержимым. Применяемая среда содержит фильтрат культурной среды с добавкой ПСТ, подвергнутой предфракционированию ультрафильтрованием в системе Пелликон® с отсеченной мембраной на МВ 300000.

В табл. 1 суммированы результаты, полученные для первой партии.

Концентрат подвергают дальнейшей очистке гель-фильтрацией на колонке Серакрила S-400® (2,6 x 190 см). В колонку загружают 32,5 мг HBsAg (1/3 объема концентрата). В 140 мл элюата выделяют 30 мг HBsAg (выход 92%). Элюаты с двух колонок объединяют, концентрируют в системе Минитен® (отсечная мембрана на МВ 300000) до 58 мл и подвергают повторной идентичной гель-фильтрации на той же самой колонке Сефакрила S-400®. Из загруженных во вторую колонку 57 мг HBsAg выделяют 48,5 мг HBsAg (85%). На первой колонке частицы HBsAg очищаются в 3-4 раза (от 15% До примерно 60% на общий белок) и еще в 1,5 раза на второй колонке (от примерно 60% до более 95% на общий белок).

Очищенные частицы HBsAg анализируют с помощью НДС-ПАГЕ (15%). Специфичные для белка HBsAg полосы проявляются визуально при окрашивании серебром и вестерн-блотировании использованием антител кролика по приведенной в примере 7 методике.

Пример 7. Анализ очищенных частиц HBsAg.

А. Чистоту частиц HBsAg после каждой стадии процесса очистки (примеры 5 и 6) определяют с помощью НДС-ПАГЕ (НДС-электрофорез в полиакриламидном геле) (15% геля) и окрашиванием геля серебром). Анализ гелей показал, что полученные после повторной гель-фильтрации (примеры 5 и 6) частицы HBsAg имеют чистоту 98-99%
С помощью НДС-ПАГЕ и окрашивания серебром сравнивают следующие образцы: осветленную сырую культурную среду, концентрат сырой осветленной среды, концентрированный элюат после первой гель-фильтрации на Сефакриле S-400® и пиковую фракцию концентрата среды, расслоеннoй в сахарозе (пример 11). Одно и то же количество белка, определяемое стандартными методами, наносят для каждого образца на гель. В случае сырой среды основные полосы соответствуют примесному белку (альбумин), в то время как характерные для белка HBsAg полосы незначительны. В концентрированной среде специфичные для белка HBsAg полосы возрастают (15% на общий белок) со значительным уменьшением примесных полос. После первой колонки Сефакрила S-400® характерные для HBsAg полосы составляют около 60% белковых полос, а примесные полосы на этом этапе незначительны. После второй колонки Сефакрила S-400® четко видны все характерные для HBsAg полосы: 24 К, 27 К, 33 К, 36 К, 39 К и 42 К, которые составляют более 95% всех белковых полос. Основными характеристиками для HBsAg полосами являются полосы для 24 К, 27 К, 33 К и 36 К, полосы 39 К и 42 К меньше, но все же значительны. Расслаиваемый в сахарозе образец дает картину, очень близкую к элюату с первой колонки Сефакрила S-400®, с иллюстрацией того, что расслаиванием в сахарозе получают частицы HBsAg чистотой только 60%
В. Очищенные частицы HBsAg после каждой стадии процесса очистки (примеры 5 и 6), кроме того, анализируют вестерн-блотированием использованием антигенов кролика, созданных к частицам HBsAg из плазмы крови. Блотированием показано наличие шести основных белковых полос, характерных для частиц HBsAg со следующими молекулярными весами: 24 К, 27 К, 33 К, 36 К, 39 К и 42 К.

Методика вестерн-блотирования с применением специфичных к частицам HBsAg антител позволяет идентифицировать характерные для частиц HBsAg полосы. Для каждого образца используют одинаковое количество белка. Применяемые антитела специфичны и к альбумину, что оказывается полезным при определении специфичного уменьшения альбумина основной белковой примеси в ходе процесса очистки.

Образец сырой среды четко показал только полосы альбумина, в то время как характерные для частиц HBsAg полосы были ниже уровня обнаружения данным методом. Для специфичного обнаружения белковых полос помощью антител уровень обнаружения определяется как количеством белка на полосу, так и их антигенностью в условиях анализа. Делается вывод, что сырая среда содержит очень небольшое количество характерных для частиц HBsAg полос), что наблюдается и в разделе A окрашиванием серебром, где уровень обнаружения составляет примерно 50 нг/полосу), и эти полосы не обладают высокой антигенностью в наших условиях анализа. Образец концентрата среды характеризуется пониженным содержанием альбумина, основные полосы соответствуют характерным для HBsAg полосам 24 K и 33 K, с меньшими полосами 27 K и 36 K. В элюате с первой колонки Сефакрила S-400® альбумин представлен небольшой полосой, основными полосами являются характерные для HBsAg полосы 24 K и 33 K с меньшими полосами 27 K, 36K и 42 K. Образец после расслаивания в сахарозе дает картину, очень похожую на картину для элюата с первой колонки Сефакрила S-400® Элюат со второй колонки Сефакрила S-400® имеет почти неразличимую полосу альбумина, основные полосы соответствуют характерным для HBsAg полосам 24 K, 27 K, 33 K, а полосы 36 K, 39 K и 42 K меньше, но тем не менее значительны. Таким образом, в этом образце почти все полосы характерны для частиц HBsAg, что указывает на их высокую чистоту. Т.е. подтверждены результаты, наблюдаемые в вышеприведенном разделе A с применением окрашивания гелей серебром.

Дальнейшее изучение интенсивности полос в вестерн-блотировании (особенно для образцов, соответствующих элюатам с первой и второй колонок Сефакрила S-400® ) показывает стехиометричность частиц HBsAg, полученных и очищенных способом заявителя, т.е. 24 K, 27 K и 33 K основные полосы, а 36 K, 39 K 42 K меньшие полосы.

Эти наблюдения находятся в полном соответствии с данными Heerman и др. J. Virol, 52, 396-402 (1982), которыми описаны следующие белки в ВГВ частицах из плазмы крови и крупные нити, содержащие только HBsAg (меньшего размера 20 нм частицы HBsAg, описанные ими, не содержат 39 K и 42 K).

24 K негликозилирован (S)
27 K гликозилирован (S)
33 K моногликозилирован (пред- S2)
36 K дигликозилирован (пред- S2)
39 K негликозилирован (пред- S1)
42 K гликозилирован (пред- S1)
Необходимо отметить, что сравнение окрашенного серебром геля и вестерн-блотирования с применением антител кролика показывает повышенную иммуногенность 33 K белка из пред- S2 области. На окрашенном серебром геле полоса 33 K меньше в сравнении с основными полосами 24 K и 27 K. При вестерн-иммуноблотировании полоса 33 K преобладает над основными полосами 24 K и 27 K. Это согласуется с открытием повышенной иммуногенности, связанной с детерминантами пред- S2 области, о чем речь шла выше в разделе "Предпосылки создания изобретения", со ссылкой, например, на Milich и др. J. Immunol, 137, 315-322 (1986).

C. Присутствие пред- S1 белков (39 K, 42 K), кроме того, показано использование специфичных моноклональных антител к пред- S1 области методом вестерн-блотирования. Блотированием показано по меньшей мере в два раза больше количества негликозилированного пред- S1 39 K по сравнению с гликозилированной формой 42 K. (Предполагается, что моноклональные антитела в равной степени реагируют с гликозилированными и негликозилированными белками).

D. Очищенный HBsAg дополнительно исследован на присутствие примесей, происходящих из ПТС и CHO клеток. С помощью методики вестерн блотирования использованием двух антител кролика соответственно к белкам ПСТ и CHO клеток удалось показать, что уровень примесей в очищенном HBsAg ниже уровня обнаружения в обоих случаях при сравнении с положительным контролем. Уровень обнаружения означает здесь как количество белка на полосу, так и их иммуногенность в условиях анализа.

Пример 8. A. Твердофазный радиоиммуноанализ для частиц HBsAg, полученных новым способом получения-очистки заявителя (описанном в примерах 5 и 6)
Для определения иммуногенности частиц HBsAg использован набор для твердофазного радиоиммуноанализа для обнаружения HBsAg ( Травенол® ). Анализу подвергались частицы HBsAg из концентрированного элюата с повторной гель-фитрацией (пример 5, стадия 5 или схема I, стадия 5). Набор калиброван по известным стандартам ( Абботт® ). Калибровочную кривую для полученного методами биотехнологии HBsAg (CHO) сравнивают с калибровочной кривой Абботта® Создается впечатление, что HBsAg (CHO) заявителя обладает большим сродством к антителам шимпанзе из набора Травенол® по сравнению со стандартом Абботта® (фиг. 5А).

B. Калибровочная кривая для вакцины рекомбинантного HBsAq, продуцированного в CHO клетках новым способом получения-очистки заявителя (пример 5).

Заявитель получил свою вакцину способом, описанным в примере 9, путем сочетания высокочистых частиц HBsAg (концентрированные частицы HBsAg, полученные на стадии 5 примера 5) с адъювантным препаратом АЛУМ.

HBsAg вакцина сравнивалась как с вакциной HBsAg из плазмы (Гептавакс B® ), так и с дрожжевой рекомбинантной вакциной (Рекомбивакс HB® ). Полученные результаты показывают, что вакцина заявителя (CHO) обладает более высоким сродством к антителам шимпанзе из набора Травенол® нежели продажные вакцины ( Гептавакс®, Рекомбивакс® ). Создается впечатление, что рекомбинантная дрожжевая вакцина Рекомбивакс HB® не реагирует в данном испытании, вероятно, вследствие очень низкого сродства к антителам, из набора Травенол PIA®.

Пример 9. Сероконверсия на небольших животных (мыши).

A. Испытание активности HBsAg сероконверсией на мышах.

Поверхностный антиген гепатита в (HBsAg), продуцированный клетками CHO-HB200 (примеры 3 и 4), подвергают высокой степени очистки (около 98% примеры 5 и 6). Концентрацию HBsAg определяют с помощью набора радиоиммуноанализа для определения HBsAg (Травенол®) и определением белка (примеры 7 и 8). HBsAg вводят в комплекс с адъювантом алюм с образованием вакцины HBsAg. Получением алюма проводят титрованием 1,5 мл 10%-ного раствора алюма (алюминийкалийсульфат 18 H₂O) избытком 1 М раствора фосфата натрия (Na₂HPO₄) (примерно 1 мл). Образовавшуюся суспензию разбавляют 10-кратно водой и центрифугируют. Осадок алюма вновь суспендируют в 10 мл ФБР с получением раствора приблизительно 2,5 мг/мл Al(OH)₃). К 1 мл этого раствора добавляют 50 мкг (микрограмм) рекомбинантных CHO HBsAg заявителя и объм доводят до 5 мл добавлением ФБР.

Рекомбинантную вакцину (CHO) заявителя сравнивают с вакциной из плазмы (Гептавакс®) производства Мерк, Шарп и Доом) и дрожжевой рекомбинантной вакциной (Рекомбивакс HB® Мерк, Шарп Доом).

Мышам линии Бальб/с инъектируют внутрибрюшинно по 1 мл образцов вакцин, каждый из которых содержит следующие количества HBsAg: 0,01, 0,03, 0,09, 0,27, 0,81, 2,4 мкг (10 мышей в группе). Через 30 дней после инъектирования мышей обескровливают и сыворотку испытывают на присутствие антител к HBsAg использованием набора Аусаб EIA® (Абботт®) с калибровкой по отношению к ссылочной сыворотке (NHO), полученной из центрального банка крови Дании.

Полученные результаты суммированы на фиг. 6. Можно сделать вывод, что рекомбинантная (CHO) вакцина заявителя по своей активности по меньшей мере в 10 раз превосходит две продажные вакцины, поступающие на рынок.

Вышеприведенные опыты повторены в большем масштабе использованием препарата рекомбинатной (CHO) вакцины заявителя особенно рекомендуемым способом, подробно изложенным в примере 11. Полученные при этом результаты аналогичны вышеописанным.

B. Исследование качества антител, образованных в испытаниях сероконверсией (описание см. в разделе A выше)
В испытаниях сероконверсией на мышах образовано три вида антител:
(a) антитела к Гептаваксу B® (плазма),
(b) антитела к Рекомбиваксу HB® (дрожжи),
(c) антитела к вакцине заявителя (CHO).

При одинаковом титре анализирую качество и специфичность антител трех видов. Частицы HBsAg (CHO) заявителя с высокой степенью очистки (пример 5, стадия 5) фракционируют электрофорезом на НДС полиакриламидном геле и переносят на фильтры из нитроцеллюлозы. С помощью методики вестерн блотирования фильтры подвергают действию антител трех видов.

Антитела мышей к Гептаваксу B® (плазма) и Рекомбиваксу HB® (дрожжи) распознают только S белок (24 K), присутствующий в частицах HBsAg, в то время как антитела мышей к вакцине (CHO) заявителя распознают и S, и пред-S2 (24 K, 33 K) белки.

Эти наблюдения вновь показывают, что вакцина вызывает более высокие титры антител по сравнению с продажными вакцинами. Более того, качество и специфичность антител, вызванных к вакцине заявителя, различаются, поскольку эти антитела распознают помимо S (белка 24 К) также и пред- S2 (33 K) белок, который считают важным при вирусной инфекции.

C. Опыты с не дающими реакции мышами.

Опыты проводят на конгенных мышах линии BI0S (получены от фирмы Нарлан Олас Лтд. Бицестер, Великобритания), для которых известно отсутствие реакции на S белок, т.е. такие мыши не будут реагировать на любую HBsAg вакцину, не содержащую пред-белков (Milich и др. Science 228, 1195-1198)). Мышей разделяют на две группы по 26 мышей в группе. Одну группу мышей инъектируют внутрибрюшинно 1 мкг вакцины Рекомбивакс HB® из дрожжей (описана в разделе "Предпосылки создания изобретения"), не содержащей пред- S1 или пред- S2 детерминант, а другую группу мышей инъектируют внутрибрюшинно 1 мкг HBsAg вакцины заявителя, полученной по методике примера 11 (это примерно в 50 раз выше нормальной дозы для мыши). Через 30 дней после первичной иммунизации половину мышей в каждой группе обескровливают и по нижеприведенной методике определяют в сыворотке титр антител. Оставшихся мышей вновь иммунизируют (вторичная иммунизация) и через две недели после вторичной иммунизации их обескровливают и по нижеприведенной методике определяют титр антител.

Сыворотку анализируют с помощью продажного набора для анализа антител к HBsAg (Аусаб RIA®, Абботт®, данным анализом обнаруживаются и количественно определяются антитела к S области. Результаты (фиг.7) показывают, что после первичной иммунизации происходит лишь небольшое повышение титра в обеих группах мышей. Однако после вторичной иммунизации вакцина заявителя вызвала повышение титра почти в 10 раз по сравнению с Рекомбиваксом® а это статистически важное различие (p<0,001). Полученные результаты показывают, что вакцина заявителя позволит преодолеть проблему отсутствия реакции, характерную для существующих вакцин.

D. Дальнейшее исследование качества антител, вызванных в испытании сероконверсией.

В дополнительных опытах сыворотка мышей с отсутствием реакции, собранная после вторичной иммунизации вакциной Рекомбивакс HB® из дрожжей и HBsAg вакциной заявителя, анализируют твердофазной ELISA на присутствие антител к пред- S1 области. В этом анализе синтетическим пептидом в 21 mer, соответствующим пред- S1 области HBsAg, покрывают полистирольные микротитровальные пластинки с 96 ячейками (Нунк, пластинки Ковалинк, Кат. 478042) в количестве 0,5 мкг на ячейку. Затем на ячейки наносят слой (с дублированием) различной сыворотки, включая сыворотку нормальной мыши в качестве отрицательного контроля. После этого последовательно проводят инкубирование с биотинилированным очищенным IqG с антимышиной аффинностью в качестве вторых антител и Extr авидин пероксидазой (окрашивающий набор фирмы Био-Макор, Кат. 7801-1). Полученные результаты (приведены в табл.3) указывают на присутствие антител к пред- S1 области в сыворотке мышей с отсутствием реакции, иммунизированных HBsAg вакциной заявителя, в отличие от отсутствия таких антител в сыворотке мышей вакцинированных вакциной Рекомбивакс® из дрожжей.

Приведенные результаты показывают, что вакцина заявителя вызывает образование антител к пред- S1 области, в то время как полученная на основе дрожжей вакцина не вызывает образования таких антител. Новизна и важность этих наблюдения обсуждается в конце примера 12.

Пример 10. Альтернативные способы очистки частиц HBsAg, секретированных культурой клеток млекопитающего.

Как показано на фиг. 4, "Схема очистки частиц HBsAg" состоит из пяти ключевых стадий. На каждой стадии могут быть использованы альтернативные способы, отличные от способов, подробно описанных в примере 5.

Кроме того, для получения очищенных частиц HBsAg могут быть применены различные сочетания альтернативных способов.

Сравнение этих альтернативных способов с теми, которые рекомендуются заявителем в его способе очистки (см. пример 5 и схему 1), проведено в табл. 2.

Ниже следует подробное описание возможных альтернативных способов для каждой стадии схемы очистки.

A. Способы, альтернативные стадии I (предфракционирование культурной среды)
Продуцирование частицы HBsAg клетки CHO (описаны в примерах 3 и 4) в альтернативном варианте могут быть выращены в следующих средах.

1. Ростовая среда, описанная в примере 3(a) и содержащая 2-10% плодной сыворотки теленка (ПСТ), предпочтительно 2% ПСТ, без предфракционирования. (предфракционирование ростовой среды описано в примере 5).

Такой альтернативный способ, однако, создает трудности при дальнейшей очистке.

Если культурную среду не предфракционировать, уровень белковых примесей на последующих стадиях очистки остается очень высоким, чистота конечного продукта снижается, так же как снижается и выход конечного продукта. Альтернативные стадии очистки, описанные для последующих этапов, в том числе: ПЭГ-фракционирование, аффинная хроматография (Аффигель Блу® Блу-Сефароза® Фенил-Сефароза® ионообменная хроматография (Гепарин-Сефароза® ДЭАЭ-Сефацель® ) и гель-фильтрация (Сефакрил S-400® ), в каждом случае использованы в сочетании с первой стадией непредфракционирования культурной среды. Из них только гель-фильтрация (Сефакрил S-400® ) проводилась вместе с предфракционированием культурной среды, продуцирующей частицы HBsAg, в рекомендуемом способе A (пример 5).

2. Ростовую среду, описанную в примере (3) и примере 5 с добавкой 2-10% ПСТ, предпочтительно 2% с предфракционированием ультрафильтрованием в системе Пелликон® (пример 5), в альтернативном варианте предфракционируют на отсечной мембране на МВ 10000 или 100000 вместо отсечной мембраны на МВ 300000.

Однако такой альтернативный способ создает трудности в выращивании клеточной культуры.

При использовании предфракционирования ультрафильтрованием в системе Пелликон® с отсеченными мембранами на МВ 10000 или МВ 100000 происходит значительное ингибирование роста клеток, что приводит к снижению выходов HBsAg.

Таким образом, рекомендуемый заявителем способ для стадии 1 это способ, показанный на схеме I и в примере 5.

B. Альтернативные способы для стадии 2 (осветление содержащей частицы HBsAg культурной среды).

Культурная среда клеток CHO, продуцирующих частицы HBsAg, которые секретируются в среду, может быть осветлена с помощью возможных альтернативных стадий.

1. Центрифугирование собранной среды в корзинах на 1 л использованием центрифуги фирмы Сорвалл® (модель PC-3B, со вращающимся корзиночным ротором) проводят при 4000 об/мин в течение 15-20 мин. Жидкая часть (очищенная от клеток и части клеточных осколков) затем последовательно обрабатывается в соответствии со стадиями 3-5 процесса очистки, показанного на схеме I.

Применение таких альтернативных методов, однако, приводит к следующим проблемам.

Центрифугированием собранной среды из нее удаляются только целые клетки, другие основные примеси, такие как клеточные мембраны и липидные комплексы, остаются в жидкой части. Это создает помехи на последующих стадиях очистки гель-фильтрацией (стадии 4, 5), что приводит к снижению общих выходов частиц HBsAg и уменьшению частоты частиц HBsAg. Кроме того, стадия центрифугирования является длительным процессом и не может быть использована для больших объемов (позволяет обрабатывать примерно 12 л/ч на центрифугу).

2. Фильтрование с помощью фильтрующих систем с фильтром на 0,22 мк обычно применяют для целей стерилизации Миллипор® Система отличается от системы ультрафильтрования Пелликон® с тангенциальным потоком и мембраной на 0,22 мк (пример 5).

Применение такого альтернативного способа приводит, однако, к следующим проблемам.

Фильтрование с использованием системы стерилизации с мембраной на 0,22 микрона (отлична от системы ультрафильтрования Пелликон® с тангенциальным потоком и отсечной мембраной на 0,22 мк) дает эффективное осветление среды с удалением целых клеток, клеточных мембран и липидных комплексов, но характеризуется следующими недостатками: в этой системе не могут быть обработаны большие объемы, поскольку стерилизующие мембраны на 0,22 мк быстро забиваются и требуют частой замены. Это приводит к потерям в выходе продукта и требует затрат времени.

Таким образом, рекомендуемая система это система, описанная для стадии 2 (см. схему I и пример 5). На этой стадии заявителем использована система ультрафильтрования Пелликон® с тангенциальным потоком и отсечной мембраной на 0,22 мк. Такая система применяется в промышленных масштабах, с ее помощью можно обрабатывать большие объемы среды, которая обрабатывается с большой скоростью (сотни литров в 1 ч). Система более устойчива к забиванию и обеспечивает 100%-ное выделение частиц HBsAg.

C. Способы, альтернативные стадии 3 (стадия концентрирования осветленной среды).

1. Фракционирование в полиэтиленгликоле (ПЭГ) с применение 10% ПЭГ (ПЭГ 600, Сигма) предназначено для осаждения высокомолекулярных белковых комплексов, в том числе частиц HBsAg. Растворенную в ФБР концентрированную форму ПЭГ (25-30%) добавляют к осветленной культурной среде (стадия 2) с установлением конечной концентрации ПЭГ 10 мас./об. Остаток в ПЭГ может быть собран центрифугированием (центрифуга фирмы Cорвалл® модель РС-38, ротор с фиксированным углом, пробирки на 50 мл, 5000-7000 об/мин, 20 мин) или фильтрованием в системе ультрафильтрования Пелликон® с тангенциальным потоком и отсеченной мембраной на МВ 300000 (показан на схеме I, стадия 3 и в примере 5). Раствор хорошо перемешивают и оставляют по меньшей мере на 30 мин при 4^oC. Надо отметить, что такую стадию фракционирования в ПЭГ проводят только в случае частиц HBsAg, продуцированных в среде, не подвергавшейся предфракционированию на стадии 1.

Использованием такого альтернативного способа концентрирования получены следующие результаты.

Фракционирование в 10% ПЭГ осветленной среды эффективно только для небольших объемов (до 1 л) осветленной культурной среды. Кроме того, и, что более важно, фракционирование в ПЭГ обеспечивает выделение только 75% частиц HBsAg. Фракционирование в 10% ПЭГ приводит к потери примерно 80% всего белка (включая 25% всех частиц HBsAg) и чистота частиц HBsAg после такого фрикционирования в 10% ПЭГ 0,5-1% И, наконец, после фракционирования в ПЭГ содержащей HBsAg осадок необходимо вновь суспендировать в ФБР и подвергнуть диализу для удаления ПЭГ. После этой стадии необходимо проведение другой стадии концентрирования перед конечными стадиями очистки (стадии 4, 5). Таким образом, фракционирование в ПЭГ требует больших затрат времени, приводит к значительным потерям частиц HBsAg, в лучшем случае представляет собой стадию предконцентрирования, требующей последующего проведения стадий концентрирования и, если суммировать, фракционирование в ПЭГ можно считать дорогим процессом. Надо отметить, что концентрирование в ПЭГ проводят в сочетании с альтернативными способами некоторых последующих стадий (например, в сочетании с ионообменной хроматографией, аффинной хроматографией или гель-фильтрацией).

2. Ультрафильтрование с тангенциальным потоком и отсечными мембранами либо на МВ 10000, либо 100000, либо 300000 (системы Минитен® и Пелликон® производства фирмы Миллипор® Такие способы с применением систем Минитен® или Пелликон® позволяют диализовать удержанный продукт (не проходящий через мембрану материал) в ходе процесса ультрафильтрования. Обычно применение такой системы заключается в следующем:
а) cистема Минитен® с отсечной мембраной на МВ 10000. 6,4 л осветленной культурной среды (стадия 2) ультрафильтруют и диализуют с 2 л фосфатного буферного солевого раствора (ФБР) (4·500 мл ФБР). В результате получают 260 мл конечного концентрата (примерно 25-кратное концентрирование);
в) cистема Пелликон® с отсечной мембраной на МВ 100000. 34 л осветленной культурной среды (стадия 2) ультрафильтруют и диализуют в 8 л ФБР (8·1 л ФБР). В итоге получают 660 мл конечного концентрата (примерно 50-кратное концентрирование);
c) cистема Пелликон® с отсеченной мембраной на МВ 300000. 34 л осветленной культурной среды (Стадия 2) ультрафильтруют и диализуют с 10 л ФБР (10·1 л ФБР). В итоге получают 500 мл конечного концентрата (примерно 70-кратное концентрирование).

Применение альтернативных способов концентрирования получают следующие результаты.

а) Ультрафильтрование и диализ в системе Минитен® с отсечной мембраной на МВ 10000 протекает медленно, вследствие чего эта система неприменима для получения частиц HBsAg в промышленных масштабах. Хотя выход частиц HBsAg очень высок (более 96%), выход общего белка также очень высок (более 95%). Таким образом, эта система очень эффективна, с точки зрения концентрирования исходного продукта без его потерь, однако она не позволяет очищать частицы HBsAg от исходных примесей, так, отношение частиц HBsAg к общему белку остается прежним (чистота частиц HBsAg только около 0,4%).

При повышении объема осветленной среды повышается количество удержанного мембраной белка до такого уровня, что скорость потока существенно снижается.

b) Ультрафильтрование и диализ в системе Пелликон® с применением мембраны на МВ 100000 более эффективно по сравнению с выше охарактеризованной в разделе (а) системой Минитен® с отсечной мембраной на МВ 10000. Могут быть обработаны большие объемы и скорость потока более высока. На мембране удерживается меньше количество белка, в результате чего скорость потока не ограничена жесткими рамками при обработке больших объемов среды, содержащих большие количества белка.

Однако, хотя концентрирование культурной среды очень эффективно, такая система не позволяет специфично очищать частицы HBsAg, выхода частиц HBsAg достигают 100% при общем выделении 95% белка, т.е. отношение частиц HBsAg остается тем же, что и в исходном материале (частота частиц HBsAg только 0,4%).

c) Ультрафильтрование и диализ в системе Пелликон® с мембраной на МВ 300000 является предпочтительным способом, который более эффективен по сравнению с обоими вышеописанными способами (a,b). В данном случае система позволяет добиваться как концентрирования, так и специфичной очистки частиц HBsAg: выход частиц HBsAg 98% при выделении только 10% первоначального общего белка. В результате отношение HBsAg к общему белку повышается на фактор 9 (чистота частиц HBsAg 3-4%).

d) Для достижения на данной стадии концентрирования дальнейшей очистки HBsAg заявитель ввел еще одну возможную альтернативную стадию, которая следует вслед за ультрафильрованием и диализом с использованием вышеописанной системы Пелликон с отсечной мембраной на МВ 300000. Такой дополнительной стадией является фракционирование в 10% ПЭГ. (Метод соответствует приведенному выше, но его отличие заключается в том, что в данном случае ПЭГ применяют после ультрафильтрования, а не вместо него).

Однако при этом происходит снижение на 28% выхода частиц HBsAg (снижение выхода с 98 до 70%), хотя и достигается снижение общего белка до целевого уровня в 2,5% (с 10%). (Чистота частиц HBsAg 7-10%). Такая альтернативная стадия фракционирования в ПЭГ после ультрафильтрования испытывалась в альтернативных системах, описанных в подразделах (a и b), вследствие высокого содержания общего белка (более 98%) после ультрафильтрования в таких системах.

Если подвести итоги, то указывается, что стадия концентрирования является решающей стадией в процессе очистки. Очень важно сконцентрировать осветленную культурную среду перед окончательной очисткой гель-фильтрацией (пример 5, схема 1). Необходимо отметить, что все вышеописанные способы использовались в приложении к осветленной сырой культурной среде, не подвергавшейся предфракционированию в момент культивирования клеток. Предфракционирование культурной среды с применением описанной системы (стадия 1, схема 1, пример 5) создано в качестве уникальной стадии, предназначенной для преодоления затруднений, накапливающихся в ходе стадии концентрирования (стадия 3) и конечной очистки (стадии 4, 5). Предфракционированием из культурной среды удаляют примеси (перед культивированием клеток) с молекулярным весом около 300000.

Рекомендуемый заявителем способ концентрирования (пример 5, схема 1) с применением системы Пелликон® с отсечной мембраной на МВ 300000 при осуществлении способа для осветленной среды, первоначально предфракционированной, дает следующие результаты: из 25 л среды получают 148 мл концентрата (диализ с ФБР в ходе концентрирования ультрафильтрованием требует 10 л ФБР). Это соответствует 170-кратному концентрированию и выделению 96% HBsAg при выделении общего белка только в количестве 2,5% (желаемый уровень). (Чистота частиц HBsAg на этой стадии 15% см. также табл.1). Все это, таким образом, сильно превосходит каждую вышеописанную альтернативную стадию (1, 2a, 2b, 2c, 2d). Таким образом, рекомендуемый заявителем способ это способ одновременного достижения на высоком уровне в одну стадию концентрирования и очистки HBsAg без значительных потерь частиц HBsAg.

d. Способы, альтернативные стадиям 4 и 5 (очистка гель-фильтрацией).

1. Аффинная хроматография на гидрофобных колонках.

Использованы три типа аффинных колонок: Блу-Сефароза® ( Фармация® ), Аффигель Блу®(Биорад®) и Фенил-Сефароза® Фармация® (Колонки используются в соответствии со специфациями, прилагаемыми фирмами Фармация® и Биорад®
Колонки Аффигеля Блу® и Блу-Cефарозы® применяют в следующем способе очистки (в сочетании с различными альтернативными способу заявителя стадиями).

Частицы HBsAg получали из культур, среды которых не предфракционировались и которые концентрировались в 10% ПЭГ (см. раздел C1, альтернатива стадии концентрирования). Осадок в ПЭГ растворяют в минимальном объеме ФБР (250 мкг белка на мл ФБР) и загружают либо в колонку Аффигеля Блу® либо в колонку Сефарозы-Блу®. Заявитель пользовался набитыми колонками на 25 мл с загрузкой 5 мл HBsAg в ФБР на колонку (1,25 мг HBsAg частиц на колонку). Колонку промывают 2 объемами (70 мл) ФБР и элюируют буфером тиоцианида натрия (NaSCN), затем 40% -ным раствором ПЭГ в ФБР. Элюирование проводят сначала промыванием 1 объемом (35 мл) 0,1 буфера NaSCN с последующим повторным промыванием 0,25 М NaSCN (35 мл). В результате эффективно удаляются белки, такие как альбумин, без удаления из колонки HBsAg. Частицы HBsAg элюируются с колонки 40%-ным раствором ПЭГ с 1 М NaSCN с ФБР. Этим методом выделяют только 10-20% частиц HBsAg без видимой разницы между колонками Аффигеля Блу® или Блу- Сефарозы®. Чистота HBsAg низка (5-7%), поскольку тот элюируется совместно с альбумином. Колонку Фенил- Сефарозы® (миниколонка с объемом слоя 2,7 мл) применяют в следующем способе очистки. Частицы HBsAg получали из клеточных культур чьи среды не подвергались предфракционированию и концентрировались и диализовались в ФБР на отсечных мембранах Пелликон® на МВ 300000. Затем проводили дополнительное фракционирование в 10% ПЭГ в ФБР с растворением осадка в ПЭГ в минимальном объеме ФБР (1,8 мл конечного объема, около 0,5 мг частиц HBsAg). Полученный продукт загружают в колонку, промытую 19 мл ФБР (7 объемов). Элюирование проводят 13,5 мл H₂O(5 объемов). Элюируется лишь 22% HBsAg низкой частоты (7%), поскольку совместно с фракцией HBsAg элюируется альбумин.

Таким образом, приведенные методы уступают рекомендуемому заявителем способу (пример 5, схема 1).

2. Ионообменная хроматография.

Применяют два типа ионообменных колонок: колонку Гепарин-Сефарозы® с объемом слоя 3 мл ( Фармация® ) и колонку ДЭАЭ-Сефацеля® с объемом слоя 2,5 мл (колонки используют в соответствии с прилагаемыми изготовителем ( Фармация® ) спецификациями).

Для обеих колонок загружаемый образец частиц HBsAg приготовляют следующим образом.

Частицы HBsAg получают из культур, чьи среды не предфракционировались. Собранную культурную среду концентрируют и диализуют на отсечной мембране Пелликон® на МВ 300000 и дополнительно концентрируют с 10% ПЭГ в ФБР. Концентрат ПЭГ (образец HBsAg) растворяют в разбавленном ФБР (0,3 · ФБР) и загружают в колонку следующим образом: 6 мл образца HBsAg (около 1,5 мг) загружают в колонку Гепарин- Сефарозы® в колонку ДЭАЭ-Сефацеля® загружают 11 мл (около 2,75 мг). Элюирование частиц HBsAg осуществляют следующим образом.

Колонку Гепарин- Сефарозы® промывают 4 объемами (12 мл) 0,3 · ФБР и элюируют градиентом раствора ФБР в интервале между 0,3 · ФБР и 2 · ФБР (30 мл 10 объемам). Из такой колонки выделяют только 10-20% HBsAg низкой чистоты (5-7%). Колонку ДЭАЭ-Сефацеля® элюируют ступенчатым градиентом раствора ФБР, для промывания колонки применяют по 1 объему (2,5 мл) каждого из следующих растворов: 0,2 ФБР, 0,3 · ФБР, 0,5 · ФБР, 0,75 · ФБР, 1 · ФБР, 1,5 · ФБР, 2 · ФБР. Это позволило вытеснить частицы HBsAg, выход был 70% но продукт распределился во многих фракциях (смазывание). К тому же чистота низка (5-10%), поскольку во всех фракциях HBsAg присутствуют примеси.

Таким образом, очистка частиц HBsAg неэффективна и этими методами.

Необходимо отметить, что в последующем испытано несколько других ионообменных колонок (см. пример 11). Применение SP-Трисакрила® привело к неожиданно хорошим результатам, и колонка была введена в рекомендуемый способ B (пример 11).

3. Гель-фильтрационная хроматография.

В качестве альтернативы рекомендуемой гель-фильтрации на Сефакриле S-400® применяют Сефарозу CL-6B®(Фармация®) ) (объем слоя в колонке 500 мл, применяют в соответствии со спецификацией изготовителя).

Гель-фильтрацию на колонке Сефарозы CL-6B® сравнивают непосредственно с гель-фильтрацией на колонке Сефакрила S- 400® (в данном методе используют колонку с объемом слоя 500 мл) следующим образом.

Частицы HBsAg получают из культур, чьи среды не предфракционировались. Собранную содержащую HBsAg культурную среду вначале концентрируют на отсечной мембране Пелликон® на МБ 300000 или отсечной мембране Амикон XM300® (Амикон Корп.) на МВ 300000, после чего фракционируют в 10% ПЭГ (этим снижают потери частиц HBsAg по сравнению с фракционированием B ПЭГ без предварительной концентрации на отсечной мембране на МВ 300000). Отсечные мембраны Пелликон® или Амикон XM300® дают одинаковые результаты. Осадок в ПЭГ (содержащий частицы HBsAg образец) предпочтительно растворяют в 1 x ФБР или в высокосолевом Трис-NaCl буфере (50 м М Трис-Тризма базовое, Сигма, 3M, NaCl аналитический, Мерк). В колонку сефакрила® или Сефарозы® загружают 8,1 мл образца HBsAg (около 2 мг). В обоих случаях образцы, загружаемые в буфере ФБР, вдвое лучше разделяются и очищаются, чем образцы, загружаемые в Трис-NaCl буфере. Отличия колонок в очистке частиц HBsAg могут быть суммированы следующим образом.

Частицы HBsAg элюируют промыванием клеток 1 объемом (500 мл) ФБР (каждая колонка принадлежит к типу с объемом слоя 500 мл). Элюируемые фракции собирают в виде образцов по 10 мл), аликвоты которых испытывают на специфичность и HBsAg (набор Травенол® описанный в примерах 8 и 9, и определение белка, описанное в примере 7). Выделение (выход) частиц HBsAg более 90% в случае колонки Сефакрила S-400® и только 75% для колонки Сефарозы CL-6B®. Чистота частиц составляет 45% для колонок Сефакрила® при загрузке в ФБР (и 20% при загрузке в буфере Трис-NaCl) и в то же время чистота продукта составляет только 20-30% для колонки Сефарозы® при загрузке образца в ФБР (чистота 10-15% при загрузке образца в буфере Трис-NaCl).

Для получения на колонках Сефакрила или Сефарозы частиц HBsAg большей чистоты проводят повторную гель-фильтрацию. Элюируемые пиковые фракции с первой гель-фильтрации концентрируют в 10% ПЭГ в ФБР и осадки в ПЭГ вновь растворяют в ФБР. Загрузку образцов во вторую колонку осуществляют по вышеприведенной методике, но на этот раз в качестве загружаемого буфера используют только ФБР. Частицы HBsAg элюируют и анализируют по той же методике, что и для первой колонки. При этом наблюдают следующее.

Если первой и второй колонкой являются колонки Сефакрила S-400® и в этом случае около 95% частиц HBsAg чистотой 60-70%
Если первой колонкой является колонка Сефакрила S-400® а второй - Сефарозы CL-6B®, то при этом выделяют только 60-70% частиц HBsAg чистотой лишь около 50%
При использовании в качестве первой и второй колонок только колонок Сефарозы Cl-6B выделяют всего 70% частиц HBsAg в очень широком пике (смазанный пик) очень низкой чистоты, всего лишь около 30%
Необходимо еще раз подчеркнуть, что вышеописанные процессы очистки проводят с частицами HBsAg, продуцированных в культурах, среды которых не предфракционировались. Стадия предфракционирования позволяет заявителю очищать частицы HBsAg до гораздо более высокого уровня без применения фракционирования концентрирования в ПЭГ на любом этапе применением только стадий, приведенных в примере 5 и показанных на схеме 1. Как показано в разделе C1 данного примера (методы, альтернативные стадии 3), фракционирование концентрирование в ПЭГ требуют центрифугирования и/или ультрафильтрования с диализом в качестве составной стадии. Все это требует затрат времени и повышает стоимость продукта.

И, наконец, как показано выше, для приготовления образцов HBsAg, предназначенных для очистки гель-фильтрацией, применяют стадию концентрирования в системах Пелликон® или Амикон XM300® с отсечными мембранами на МВ 300000. В обеих случаях достигают одинакового результата, но при использовании системы Амикон® можно обрабатывать всего 50 мл образца при необходимости использования рабочее давление в 50 psi (3,5 ат). В системе Пелликон® можно обрабатывать гораздо большие объемы при рабочем давлении O psi (O ат). Это важно с точки зрения промышленного применения и понижения стоимости продукта.

Таким образом, рекомендуемый способ включает два последовательных пропускания препаратов HBsAg через Сефакрил S-400® причем препараты получены из клеточных культур, чьи среды предфракционировались. В результате конечные частицы HBsAg имеют после повторного пропускания чистоту выше 95% (пример 5 и схема 1). Такая стадия к тому же и более экономична, поскольку используют одну и ту же колонку для двух последовательных пропусканий.

4. При еще одной альтернативе стадии повторной гель-фильтрации (стадия 5 на схеме 1 и в примере 5) частицы HBsAg, элюированные с первой колонки Сефакрила S-400®, загружают в градиент сахарозы следующим образом.

Частицы HBsAg получены из культур, чьи среды предфракционировались. Содержащую HBsAg среду обрабатывают по приведенной в примере 5 методики вплоть до конца стадии 4 (т.е. стадии 1-4 включительно).

Очищенные частицы HBsAg (после гель-фильтрации на первой колонке Сефакрила S- 400® ) загружают в 50-5% градиент сахарозы (приготовлен в ФБР) в пробирках ультрацентрифуги Бекман SW 27. Градиент сахарозы ультрацентрифугируют при 27000 об/мин, 16-21^oC, 18 ч. После центрифугирования со дна пробирок отбирают фракции по 1,8 мл и в них определяют концентрацию сахарозы (с помощью рефрактометра), а также HBsAg - специфичность (по методике примера 7). Характерный для частиц HBsAg пик расположен в виде острого пика во фракциях 6-7. Подобный характер расслаивания HBsAg в градиенте сахарозы указывает на высокую гомогенность частиц HBsAg, полученных способом заявителя (фиг. 4).

Дальнейшие исследования (подробно описаны в примере 7) чистоты HBsAg после расслаивания в сахарозе не показали улучшения в чистоте (60-70%) частиц HBsAg, полученных данным способом (на что указано в примере 7 после НДС-ПАГЭ и анализе вестерн-блотированием). Кроме того, выхода также меньше достигаемых при использовании гель-фильтрации (выход только около 70%). Помимо этого способ с применением градиента сахарозы очень длителен и требует применения дорогого оборудования.

5. При еще одной возможной альтернативе стадии повторной гель-фильтрации (стадия 5 на схеме 1 и в примере 5) для достижения высокой чистоты частиц HBsAg их после элюирования с первой колонки Сефакрила S-400® загружают в градиент CsCl и разделяют центрифугированием (подробности методик ультрацентрифугирования с градиентом CsCl приведены в работах: Hilleman и др. J. Infection 7, приложение 1,3-8 (1983) и Adamowicz и др. Vaccine 2, 209-214 (1984)).

При разделении с помощью градиента CsCl (изопикническое расслаивание) получены следующие результаты. Выделяют частицы HBsAg высокой чистоты (более 90% ), но с низким выходом (40-50%). Такое снижение выхода связано с необходимостью диализа частиц HBsAg, выделенных из градиента CsCl, где диализ ведут в диализных мешках, на которые налипают частицы HBsAg. Кроме того, ультрацентрифугирование в градиенте CsCl очень дорого и длительно, вследствие чего неприменимо в промышленности. Таким образом, рекомендуемым способом остается способ, описанный в примере 5 и показанный на схеме I.

В табл. 2 (где выход выражают количеством HBsAg, полученным на конечной стадии процесса в от начального количества в начале процесса, а чистоту выражают количеством частиц HBsAg, присутствующих после конечной стадии процесса в от всего белка, полученного на этой стадии) приведено сравнение рекомендуемого заявителем нового способа очистки частиц HBsAg с альтернативными способами, применяемыми для очистки частиц HBsAg. Включены возможные альтернативные способы, использованные заявителем в ходе создания своей системы. Подробности рекомендуемого способа приведены в примере 5 и на схеме 1. Подробности альтернативных способов приведены выше в примере 10. Подробности особенно рекомендуемого способа (рекомендуемый способ B) приведены в примере 11 и на схеме II.

Пример 11. Рекомендуемый способ B для получения и очистки частиц HBsAg (особенно рекомендуемый способ)
A. Подробное описание процесса получения очистки HBsAg.

Технологическая схема, иллюстрирующая данный способ, приведена на схеме II.

Необходимо отметить, что на всех стадиях применяют безпирогенную воду и сосуды.

Стадии 1-3. Эти стадии соответствуют стадиям 1-3 рекомендуемого способа A (пример 3).

Стадия 4. Обработка ДНКазой частиц HBsAg из концентрированной осветленной культурной среды
160 мл удержанного продукта (или концентрата), выделенного в системе Минитен® на стадии 3 обрабатывают содержимым одной ампулы на 11700 единиц безпротеазной ДНКазы (Юнайтид Стейтс Биокемикл Корпорейшн). Инкубирование ведут 2 ч при комнатной температуре, и в результате такой обработки содержание ДНК уменьшается с 20 нг/мкг HBsAg до 2 нг/мкг HBsAg.

В конце обработки ДНКазой белковый раствор разбавляют в отношении 1:5 добавлением 20 мМ NaAc (рH 4,5). При необходимости устанавливают pH 4,5. Разбавление проводят в силиконизированных бутылках для предотвращения адсорбции HBsAg.

После разбавления и подкисления наблюдается помутнение которое ликвидируют центрифугированием в центрифуге Сорвалл® при 12000 об/мин (30 мин). Жидкая часть (850 мл) содержит HBsAg.

Следует заметить, что разбавление и подкисление проводят с целью сделать раствор пригодным для колонки Трисакрила стадии 5, в которую должен быть добавлен раствор с низким содержанием солей и низким pH. Неожиданно образующаяся в результате муть содержит альбумин и другие примеси, но не HBsAg. Удаление образовавшейся мути центрифугированием приводит в результате к очистке без потерь HBsAg.

Стадия 5. Ионообменная очистка частиц HBsAg после обработки ДНКазой.

На этом этапе жидкую часть после центрифугирования на предшествующей стадии подают в катионообменную колонку SP- Трисакрила® LS (IBE, Франция). Для очистки HBsAg испытаны многие ионообменные смолы (см. нижеследующий раздел C). Неожиданно катионообменная колонка SP-Трисакрила® LS оказалась единственной колонкой, обладающей большой емкостью и обеспечивающей как высокие выходы, так и высокую степень очистки. SP-Трисакрил® LS представляет собой сополимер N-акрилоил-2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиола, имеющий функциональные сульфокислотные группы следующего строения: -CONH-C(CH₃)₂-CH₂SO₃H.

Примененная колонка имеет размеры 5 х 21,5 см (Фармация®) и заполнена 430 мл SP-Трисакрила® LS с максимальной линейной скоростью потока 3,6 (720 мл/ч).

Колонку приводят в равновесное состояние при вышеуказанной скорости потока 5 объемами слоя 20 мМ NaAc (pH 4,5). После загрузки колонку промывают 3 объемами слоя 50 мМ NaCl в 20 мМ NaAc (pH 4,5).

Элюат со стадий загрузки и промывки, содержащий ДНК и продукты разрушения ДНК, отбрасывают. Элюирование HBsAg начинается при замене буфера на 140-200 мМ NaCl в 20 мМ NaAc. Линейная скорость потока на стадии элюирования 6,3 (1260 мл/ч). Протекание элюирования непрерывно контролируют по поглощению элюата при 280 нм. Появляются два пика, первый из которых содержит чистый HBsAg, а второй некоторое количество примеси альбумина, количество которого зависит от концентрации применяемого NaCl. На этой стадии из колонки в одном объеме слоя вытесняют около 80% HBsAg. Первый пик с очень низким содержанием HBaAg отбирают для следующей стадии.

Стадия 5А. Элюат HBsAg с колонки SP-Трисакрила® инкубируют в разбавлении 1: 400 с 37%-ным формальдегидом (USP чистоты) в течение 48 ч при 30^oC. При такой обработке происходит дезактивация возможных присутствующих вирусов, и ее проводят единственно в качестве профилактической меры.

Стадия 6. Концентрирование и очистка.

Содержащий HBsAg раствор с предшествующей стадии концентрируют в системе ультрафильтрования Минитен® или Пелликон® с отсечными мембранами на МВ 100000. Скорость пропускания через систему 1 л/ч. HBsAg через мембрану не проходит и его собирают в виде удержанного продукта. Раствор удержанного продукта сконцентрирован примерно на 50% от его начального объема.

Концентрированный раствор удержанного продукта затем обрабатывают также, как на стадии 4 рекомендуемого способа А. Раствор подают в две сообщающиеся гель-фильтрационные колонки сверхмелкого Сефакрила-400® размером 5 х 100 см, заполненных смолой в общем объеме 4 л, при скорости потока 140 мл/ч. Или же может быть использована одна колонка большего размера.

Колонку уравновешивают при указанной скорости потока по меньшей мере 2 объемами слоя буфера ФБР (пример 5).

HBsAg элюируется после холостого объема и отличается высокой частотой (более 98%). Формальдегид удерживается колонкой и элюируется после примерно одного объема слоя. Заявитель полагает, что можно опустить данную стадию хроматографии на Сефакриле-400® без существенного урона для очистки, и в этом случае формальдегид удаляется диафильтрованием в системе ультрафильтрования Минитен® или Пелликон®
Содержащий HBsAg элюат с колонки Сефакрила-400® может быть стерилизован фильтрованием через фильтр Гелман ACRO 50 A (0,2 мк) в стеклянные бутылки.

B. Преимущества рекомендуемого способа B перед рекомендуемым способом A (пример 5).

Этим новым способом получают высокоэффективный продукт, который даже более чист, чем продукт, полученный предшествующим способом. Чистота продукта (в отношении белка) выше 98% и загрязнение ДНК ниже 0,3 мг на мг HBsAg, т. е. продукт имеет клиническую чистоту. Этот новый особенно рекомендуемый способ остается простым, включая 5-6 стадий, он быстр и очень эффективен. В результате получают высокочистый продукт при очень низких затратах.

C. Преимущества колонки SP-Трисакрила® LS, применяемой на стадии 5, над другими ионообменными колонками.

Испытаны многие колонки со сравнением их способности еще больше очищать частицы HBsAg после начальных стадий очистки 1-3. SP-Трисакрил®, как доказано, оказался единственной ионообменной смолой, обладающей сечением достаточной емкости для HBsAg, а также обеспечением высоких выходов и чистоты.

Для иллюстрации неожиданности успешного применения колонки SP-Трисакрила® для очистки частиц HBsAg ниже следует описание применения всех испытанных колонок. Приведенные испытания ясно показывают, что колонка SP-Трисакрила® обладает неожиданным преимуществом перед другими испытанными колонками.

Колонки, испытанные после стадии 3, для очистки частиц HBsAg.

(a) S-Сефароза.

Затруднения: (1) низкий выход, высокое срoдство к частицам, (2) cвязанные ДНК и элюирование с частицами
(b) Сульфат декстрана.

Затруднения: (1) oчень низкая емкость, (2) выход колеблется в зависимости от состояния буфера.

(c) На Ультрагель.

Затруднения: (1) oчень низкая емкость, (2) плохое выделение.

(d) НТР Биoгель.

Затруднения: только 50% выделения, высокое сродство HBsAg к НТР Биогелю®.

(e) ДЭАЭ-Сефароза.

Затруднения: низкая емкость, выход не определялся.

(f) SP-Трисакрил®.

Преимущества: высокая емкость и высокое выделение (выход).

Пример 12. Сероконверсия у человека.

Вакцину рекомбинантных HBsAg заявителя (приготовлена по методике примера II) инъектируют взрослым добровольцам, и использованием промышленного аналитического набора для обнаружения антител к HBsAg (Аусаб EIA® или Аусаб RIA® фирмы Абботт® ) показано возникновение высокого титра антител к вакцине.

Кроме того, выявлен субъект с отсутствием реакции, т.е. человек, не дающий реакции на предшествующую вакцинацию рекомбинантными HBsAg, полученных из дрожжей. Инъектирование вакциной рекомбинантных HBsAg заявителя вызвало образование антител к HBsAg. Это указывает на то, что вакцина рекомбинантных HBsAg заявителя должна бы приводить к более высокому числу иммунизированных субъектов по сравнению с существующими в настоящее время вакцинами.

Дальнейшее исследование качества антител, образованных у людей.

У человека, иммунизированного HBsAg вакциной заявителя, отбирают сыворотку и сравнивают с сывороткой человека, иммунизированного вакциной Рекомбивакс® а также больного, страдающего инфицированием гепатитом B. Сыворотку анализируют на присутствие антител к пред- S1 области с помощью твердофазного ELISA (описание см. в примере 9, раздел D), где вторым антителом является биотинилированный очищенный IoC с антисродством к человеку (Сигма, Каталог B-9015). Полученные результаты приведены в табл.4 (где не пр. означает не проводился).

Из табл. 4 видно, что в крови человека, иммунизированного вакциной заявителя, имеются антитела к пред- S1-области, и уровень этих антител аналогичен уровню в крови больного, страдающего инфицированием гепатитом B. Однако, кровь человека, иммунизированного дрожжевой вакциной Рекомбивакс® не содержит антител к пред- S1 области.

Заявитель полагает, что впервые показана способность вакцины рекомбинантных HBsAg вызывать продуцирование антител к пред- S1 области, и эти наблюдения показывают, что вакцина заявителя более эффективна, чем существующие вакцины с точки зрения преодоления затруднений, связанных с отсутствием реакции на детерминанты S области или пред- S2 области за счет наличия детерминант пред- S1 области (Zuckerman, J. Infection 13, 61-67 (1986) (Приложение A).

Пример 13. Рекомендуемый способ C для получения и очистки HBsAg
A. Подробное описание процесса получения очистки HBsAg (рекомендуемого способа C). Иллюстрирующая данный способ технологическая схема III приведена ниже.

Стадии 1-3. Данные стадии соответствуют стадиям 1-3 рекомендуемого способа A (пример 5) и рекомендуемого способа B (пример 11).

Стадия 4. Очистка частиц HBsAg на ДЭАЭ анионообменной колонке. Удержанный продукт или концентрат (100-400 мл), выделенный в системе Минитен® или Пелликон® стадии 3, наносят на ионообменную колонку, заполненную 400-900 мл ДЭАЭ-смолы с большой пропускной способностью, суспендированной и уравновешенной 1xФБР (pH 7,35 ± 0,05).

Жидкость из колонки собирают, затем колонку промывают (0,5 объема загрузки) 1x ФБР, элюат собирают и объединяют с жидкостью из колонки (общий объем 1,5 объема загрузки).

После ДЭАЭ-колонки белковый раствор разбавляют в отношении 1:3 10 мМ NaAc (pH 4,5) и подкисляют до pH 4,5. После такого разбавления не наблюдается помутнения в отличие от аналогичного процесса в конце стадии 4 в рекомендуемом способе, что связано с почти полным удалением альбумина на ДЭАЭ-колонке. Поэтому стадия центрифугирования для удаления мути может быть изъята.

Необходимо напомнить, что возможная дополнительная стадия заключается в обработке концентрата со стадии 3 (см. рекомендуемый способ B, стадия 4) ДНКазой перед стадией хроматографии на ДЭАЭ-колонке.

Стадия 5. Ионообменная очистка частиц HBsAg. На данной стадии разбавленный и подкисленный раствор, собранный с колонки на предшествующей стадии, подают в катионообменную колонку (SP Трисакрил® IS) в соответствии с рекомендуемым способом B (пример 11).

Стадия 5A. Обработка формальдегидом. HBsAg, элюированные с колонки SP- Трисакрила® обрабатывают формальдегидом в соответствии со стадией 5A рекомендуемого способа B (пример II).

Стадия 6. Удаление формальдегида и стерилизация. Формальдегид удаляют из обработанного на последней стадии формальдегидом раствора HBsAg диализом. Диализ проводят в системе Минитен® (или Пелликон®) с отсечными мембранами на МВ 30000 или 100000. Диализ завершают после 3-4 циклов конденсации и диализа, когда удержанный продукт сконцентрирован примерно до 50 мл. Систему ультрафильтрования промывают 1xФБР, который добавляют к удержанному продукту в таком количестве, что полный конечный объем удержанного продукта составляет 100 мл. Раствор HBsAg стерилизуют фильтрованием через фильтр на 0,2 мк и хранят при 4^oC.

B. Преимущества рекомендуемого способа C перед рекомендуемым способом В (пример 11).

Этим новым способом получают продукт примерно той же степени чистоты, что и предшествующим способом (рекомендуемый способ B). Выход продукта также примерно такой же, что и в рекомендуемом способе B. Кроме того, анализ частиц HBsAg, полученных способом C, показывает их идентичность с частицами, полученными способом B. Превосходство данного нового способа заключается в его большей простоте, в результате чего получают продукт очень высокой чистоты с очень низкими затратами. Способ более прост поскольку:
(a) замена стадии обработки ДНКазой рекомендуемого способа B хроматографией на ДЭАЭ колонке одновременно ликвидирует обременительную стадию центрифугирования, стоимость всего процесса также снижается вследствие исключения стоимости ДНКазы,
(b) стадию концентрирования перед стадией обработки формальдегидом исключает, в ней нет необходимости из-за отсутствия последующей стадии гель-фильтрации,
(c) требующие времени стадии уравновешивания, пропускания и регенерации колонки Сефакрила® опущены,
(d) стадия концентрирования после хроматографии на колонке Сефакрила® (гель-фильтрация) опущена.

C. Преимущества колонки ДЭАЭ-Сефарозы
Данная стадия ионообменной хроматографии, как полагают, являются новшеством в чистке частиц HBsAg. Эта стадия нова потому, что частицы HBsAg не связываются и не удерживаются колонкой, а проходят прямо через нее. Очистка происходит за счет связывания или удерживания в колонке примесей, так ДНК связывается с колонкой (поэтому стадия обработки ДНКазой способа B может быть исключена), а основная белковая примесь альбумин удерживается колонкой и элюируется после частиц HBsAg. Аналогично и другие анионные примеси, такие как белки, заряженные липиды, полисахариды и фрагментны мембранб отделяются от частиц HBsAg. Кроме того, индикаторы pH (красители) из среды клеточной культуры также связываются с колонкой, в результате чего отделяются от частиц HBsAg. После такой легко осуществимой стадии чистоты частиц HBsAg превышает 90%
Необходимо отметить, что ДЭАЭ колонка в используемом здесь варианте обладает большей производительностью, поскольку условия (pH, ионная сила) подбирают такими, при которых частицы проходят сразу через колонку (в этом отличие от попытки применить ДЭАЭ колонку, описанной в примере II, раздел C (e), где заявителю не удалось достигнуть очистки частиц HBsAg за счет их связывания с ДЭАЭ колонкой).

Схема III. Рекомендуемый способ для получения и очистки частиц HBsAg
Стадия 1-3. Как на схеме 1.

Стадия 4. Удержанный на стадии 3 продукт очищают на ДЭАЭ-колонке с быстрым пропусканием. Прошедшую через колонку фракцию собирают, разбавляют в отношении 1:3 и подкисляют до pH 4,5.

Стадия 5. Подкисленную и разбавленную прошедшую через колонку фракцию очищают на колонке SP- Трисакрила® LS.

Стадия 5a. Элюат со стадии 5 обрабатывают формальдегидом.

Стадия 6. Диализ с удалением формальдегида на отсечной мембране Минитен® или Пелликон® (МВ 30К или 100К). Концентрированный удержанный продукт стерилизуют фильтрованием через фильтр на 0,2 мк.

Формула изобретения

1. Способ получения очищенных частиц поверхностного антигена гепатита B, включающий культивирование культуры клеток млекопитающих на питательной среде с сывороткой с последующим концентрированием и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что используют сыворотку, не содержащую веществ с мол. м. более 3·10⁵ дальтон.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что из культур клеток используют клетки яичника китайского хомяка штамм СНО-НВ200.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что из сывороток используют сыворотку теленка.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрирование и очистку проводят хроматографированием на колонке, заполненной сополимером N-акрилоил-2-амино-2-гидроксиметил-1,3-пропандиола с функциональными группами -CONH-C(CH₃)₂-CH₂-SO₃H.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что очистку проводят ДНК-азой.

6. Способ по п. 1, отличающийся тем, что концентрирование и очистку проводят многоэтапной ультрафильтрацией и диализом.

7. Очищенная частица поверхностного антигена гепатита B человека, содержащая полипептиды, отличающаяся тем, что из полипептидов содержит S 24КД негликозилированный, S 27 КД гликозилированный, pre-S 2-33 КД моногликозилированный, pre-S 2-36 КД дигликозилированный, pre-S 1-39 КД негликозилированный, pre-S 1-41 КД гликозилированный при следующем соотношении, мас.

S 24 КД негликозилированный 62,4
S 27 КД гликозилированный 15,6
pre-S 2-33 КД моногликозилированный 10,8
pre-S 2-36 КД дигликозилированный 3,2
pre-S-139 КД негликозилированный 6,1
pre-S 1-41 КД гликозилированный 1,9
8. Вакцина против гепатита B, содержащая полипептиды и приемлемый носитель, отличающаяся тем, что из полипептидов она содержит полипептиды S 24 КД негликозилированный, S 27 КД гликозилированный, pre-S 2-33 КД моноглизилированный, pre-S 2-36 КД дигликозилированный, pre-S 1-39 КД негликозилированныйm pre-S 1-41 КД гликозилированный в эффективном для иммунизации количестве, причем вакцина свободна от других полипептидов вирусного или человеческого происхождения.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15