Способ изготовления ассоциированной вакцины против ботулизма и псевдомоноза норок

 

Изобретение относится к ветеринарии, а именно к способу изготовления ассоциированной вакцины против ботулизма и пседомоноза норок и повышение иммуногенной активности биопрепарата. Сущность изобретения состоит в том, что способ включает раздельное приготовление ботулинической анатоксин-вакцины из штамма N 59 типа С с биологической активностью 400 600 тыс. летальных доз токсина для белых мышей в объеме 1,0 см с добавлением алюмокалиевых квасцов для адсорбции ботулинического антигена и обработки физиологическим раствором, смеси инактивированных культур синегнойной палочки четырех штаммов NN 40 /381-П-06/ 48 /1 011/, 63 /1677 08/ и 77 /"Дн"/05/ с концентрацией микробных клеток 8 9 млрд. в 1 см³, смешивание их в определенной пропорции. Преимущества изобретения сводятся к получению биопрепарата, стерильного, безвредного для животных и обладающего высокой иммуногенной активностью. 3 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и касается ассоциированной вакцины, используемой для специфической профилактики ботулизма и псевдомоноза норок.

Ботулизм острое токсикоинфекционное заболевание норок, вызываемое Cl. Boulinum типа С, приводит к 100%-ной гибели неиммунизированных животных, что наносит значительный экономический ущерб зверохозяйствам страны. Ведущее место в борьбе с ботулизмом занимает специфическая профилактика с использованием вакцинных препаратов.

Известна вакцина против ботулизма норок, которую вводят внутримышечно в объеме 1,0-2,5 см³ щенкам в возрасте 40-45 дней.

Псевдомоноз широко распространенное заболевание животных, в том числе и пушных зверей, вызываемое Ps.aеruginosa. Наиболее злокачественно протекает у норок, проявляется энзоотически и сопровождается геморрагическим воспалением и отеком органов дыхания. Гибель зверей от псевдомоноза в очаге инфекции достигает 50 и более процентов. Возбудитель псевдомоноза обладает серотиповой вариабельностью. Превалирующими штаммами Ps.aeruginosa, выделенными от норок, является 05, 06 и 08 серологические варианты по классификации Хабс. Редко встречается штамм 011 серологического варианта. Для специфической профилактики используют вакцинные препараты на основе штаммов Ps.aeruginosa. Вакцины применяют зверям внутримышечно в объеме 1,0-3,0 см³ в возрасте 90 дней и старше.

Целью изобретения является способ изготовления вакцины и повышение иммуногенной активности биопрепарата.

Это достигается тем, что используемая ассоциированная вакцина против ботулизма и псевдомоноза норок готовится из штамма N 59 Cl.botulinum типа С с биологической активностью 400-600 тыс. летальных доз токсина для белых мышей до инактивации, из штаммов Ps.aeruginosa NN 40 (381-П-06), 48 (1-011), 63 (1677-08) и 77 ("Дн"-05) с концентрацией 8-9 млрд микробных клеток в 1 см³. В качестве вспомогательных веществ используются алюмокалиевые квасцы и физиологический раствор.

Вакцина готовится при следующем соотношении компонентов в об.

Анатоксин-вакцина из штамма N 59 Cl botulinum с биологической активностью 400-600 тыс. летальных доз токсина для белых мышей до инактивации 45-50 Смесь инактивированных культур Ps aеruginosa из штамма NN 40, 48, 63 и 77 с концентрацией микроб-
ных клеток 8-9 млрд. в 1 см³ 25-30 Алюмокалиевые квасцы 10-12
Физиологический раствор Остальное
Для изготовления вакцины применяют:
штамм N 59 Сl.botulinum типа С; штаммы Ps.aeruginosa N 40, N 48, N 63, N 77. Все штаммы депонированы в коллекции микроорганизмов ВГНКИ ветпрепаратов.

П р и м е р 1. Получение ассоциированной вакцины против ботулизма и псевдомоноза норок осуществляют вначале путем раздельного приготовления каждого антигена, затем объединяют их в определенной пропорции с добавлением алюмокалиевых квасцов и физиологического раствора.

Для получения ботулинического токсина используют либо мясо-пептонный печеночный бульон (среда Китт-Тарроци), либо ростовая среда Хоттингера. Непосредственно перед засевом в ростовую среду вносят 0,5-0,6% глюкозы, затем засевают отобранной матровой культурой Сl.botulinum в количестве 3-5% к объему ростовой среды. После 6-8-дневного выращивания при температуре 32 ± 0,5^оС проверяют микроскопически чистоту роста культуры, полученную культуральную жидкость фильтруют и определяют биологическую активность ботулинического токсина на белых мышах.

Для инактивации культуры Сl.botulinum вносят формалин (с содержанием формальдегида 37-38%) вначале 0,4% через 6-7 сут еще 0,15% Инактивацию культуры и превращение токсина в анатоксин проводят в течение 30-35 сут при температуре (37 ± 0,5)^оС при ежедневном перемешивании 2-4 раза в течение 10-15 мин. По истечении этого срока проверяют на стерильность путем посева на питательные среды и на полноту инактивации путем подкожного введения белым мышам в объеме 1,0 см³. Добавляют 10%-ный раствор алюмокалиевых квасцов в количестве 10-12% к объему среды при постоянном перемешивании, медленно охлаждают до температуры (19 ± 1)^оС и оставляют для осаждения адсорбированного анатоксина и инактивированной культуры Cl.botulinum на 72-96 ч. После просветления надосадочной жидкости осторожно сливают 50% супернатанта, при постоянном перемешивании добавляют физиологический раствор до первоначального объема и оставляют в покое до изготовления ассоциированной вакцины.

Для получения бактериальных антигенов Ps.aeruginosa штаммов NN40, 48,63 и 77 выращивают каждый штамм раздельно, используя в качестве ростовой среды бульон Хоттингера. Засевают матровой расплодкой в количестве 8-10% от объема среды, перемешивают в течение 3-5 мин и оставляют в состоянии покоя в течение 4-6 ч.

Перед засевом для исключения пенообразования к ростовой среде добавляют растительное масло. По истечении указанного срока проводят аэрирование среды при давлении 30/50 кПа и постоянное перемешивание механической мешалкой при температуре (37 ± 0,5)^оС в течение 20-24 ч до получения 16-18 млрд. микробных клеток в 1 см³. После чего прекращают аэрирование и перемешивание, оставляют в течение 10-15 ч, в это время происходит снижение концентрации микробных клеток до 8-9 млрд в 1 см³.

Культуры Ps.aeruginosa всех штаммов объединяют в равных объемах в одном реакторе, добавляют формалин (содержание формальдегида не менее 36%) из расчета 0,3-0,4% к общему объему бактериальной массы. Для инактивации смесь выдерживают при температуре 37 ± 0,5^оС в течение 18-24 сут при периодическом перемешивании (ежедневно 4-6 раз по 15-20 мин). Проверяют на стерильность и безвредность для лабораторных животных (белые мыши, морские свинки).

Перед изготовлением ассоциированной вакцины ботулиническую анатоксин-вакцину тщательно перемешивают в течение одних суток, оставляют в полном покое в течение 72-96 ч до полного осаждения адсорбированного ботулинического анатоксина и осторожно сливают 50% надосадочной жидкости. Затем включат механическую мешалку, при постоянном перемешивании добавляют 25-30% общей смеси культур Ps aeruginosa и доводят физиологическим раствором до первоначального объема ботулинической анатоксин-вакцины.

Полученная ассоциированная вакцина имеет соотношения компонентов, приведенные в табл.1.

П р и м е р 2. Для изучения иммуногенной активности предложенной вакцины по примеру 1 иммунизируют белых мышей, морских свинок и норок. При этом берут ассоциированную вакцину против ботулизма и псевдомоноза норок, содержащую, об.

Анатоксин-вакцина из
штамма N 59 Cl
Botulinum типа С с актив-
ностью 500 тыс. леталь-
ных доз токсина для белых
мышей в 1 см³ до инак-
тивации 47,5
Смесь инактивированных
культур Ps aeruginosa
из штаммов NN 40, 48, 63
и 77 с концентрацией мик-
робных клеток 8,5 млрд
в 1 см³ 27,5
Алюмокалиевые квасцы 11
Физиологический раствор Остальное вводят белым мышам в объеме 0,05-0,4 см³, морским свинкам 0,4-0,6 см³, норкам 0,9-1,1 см³ и через 21 день после иммунизации заражают вирулентными штаммами соответствующих возбудителей. Параллельно испытывают моновакцины против ботулизма и псевдомоноза.

Результаты исследований приведены в табл.2.

На основании данных табл.2 можно заключить, что предложенная ассоциированная вакцина обладает достаточно высокой иммуногенной активностью.

П р и м е р 3. Изучение безвредности вакцины. Для этого животным вводят многократные объемы биопрепарата различными методами. Параллельно для сравнения испытывают моновакцины. Результаты исследований приведены в табл.3.

Из данных табл.3 видно, что при введении многократных доз ассоциированной вакцины все животные в течение 10-дневного наблюдения не проявили отклонения от физиологической нормы и остались живыми.

Формула изобретения

СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ АССОЦИИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ БОТУЛИЗМА И ПСЕВДОМОНОЗА НОРОК, включающий раздельное приготовление анатоксин-вакцины из штамма N 59 Cl. botulinum типа С с биологической активностью 400 600 тыс. летальных доз токсина для белых мышей в 1 см³ с добавлением алюмокалиевых квасцов для адсорбции ботулинического антигена и обработки физиологическим раствором и смеси инактивированных культур Ps. aeruginosa из штаммов N 40, 48, 63 и 77 с концентрацией микробных клеток 8 9 млрд в 1 см³, смешивание их и получение ассоциированной вакцины при следующем соотношении компонентов, об.

Анатоксин-вакцина из штамма N 59 Cl. botulinum типа C с активностью 400 600 тыс. летальных доз токсина для белых мышей в 1 см³ до инактивации 45 50
Смесь инактивированных культур Ps. aeruginosa из штаммов N 40, 48, 63 и 77 с концентрацией микробных клеток 8 9 млрд в 1 см³ 25 30
Алюмокалиевые квасцы 10 12
Физиологический раствор Остальное

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3