Способ получения конъюгата аймалина с бычьим сывороточным альбумином

 

Изобретение относится к биохимии и иммунологии, а именно к способу получения конъюгированного антигена аймалин - белок, который используется для получения антител к аймалину, необходимых для иммуноферментного анализа, а также других иммуноаналитических методов определения аймалина как в процессе выделения его из растительного материала, так и для лекарственного мониторинга при лечении аймалином сердечных заболеваний. Целью изобретения является упрощение, ускорение способа получения конъюгированного антигена аймалин - белковый носитель, усиление его иммуногенности и улучшение специфичности получаемых антител. Поставленная цель достигается тем, что бычий сывороточный альбумин предварительно активируют глутаровым альдегидом при pH 9,5 в течение 2 ч; после удаления избытка глутарового альдегида диализом добавляют аймалин в соотношении 1:30 и через 2 ч диализуют против фосфатно-солевого буфера pH 7,3. Титр полученной антисыворотки составляет 1:4096, процент перекрестного связывания с аналогами аймалина составляет 0-1,5%, а с 17-о-ацетилаймалином 87%. 1 табл.

Изобретение относится к биохимии и иммунологии, а именно к способу получения конъюгированного антигена аймалин белок, который используется для получения антител к аймалину, необходимых для иммуноаналитических методов определения аймалина как в процессе выделения его из растительного материала, так и для лекарственного мониторинга при лечении аймалином сердечных заболеваний.

Конъюгированию низкомолекулярных соединений с белками с целью получения антител к ним, различным способам химической модификации этих соединений в зависимости от химической структуры их молекулы уделяется большое внимание. Известны способы получения комплексов (гаптен белковый носитель) для таких соединений, как морфин и его аналоги, простагландины, гормоны (тироксин, кортизол), сердечные гликозиды и т.д. [1,2,4] Однако по-прежнему остается задача получения высокоспецифичных антител к индольному алкалоиду аймалину, используемому при лечении сердечно-сосудистых заболеваний [4] Наиболее близким к предлагаемому является способ получения конъюгированного антигена аймалин белковый носитель, заключающийся в первоначальном получении гемисукцината аймалина путем растворения аймалина и янтарного ангидрида в пиридине и кипячения раствора в течение часа. Затем раствор трижды экстрагировали хлороформом и хлороформную фракцию концентрировали в вакууме и добавляли петролейный эфир. Осадок гемисукцината аймалина отфильтровывали и перекристаллизовывали. К раствору гемисукцината аймалина в водном пиридине добавляли раствор 1-этил-3-(-диметиламинопропил)-карбодиимида гидрохлорида в водном пиридине и перемешивали в течение 10 мин. Затем добавляли водный раствор бычьего сывороточного альбумино (БСА), смесь перемешивали при комнатной температуре 20 ч и диализовали против воды 4 дня [5] Недостатком способа является сложность, связанная с его многостадийностью, длительностью проведения реакции. Полученная антисыворотка имеет титр (максимальное разведение) 1:3600 и дает неспецифическое связывание 1,3-1,5% с близкими по химическому составу алкалоидами, а с 17-монохлорацетилаймалином до 90% Цель изобретения упрощение, ускорение способа получения конъюгированного антигена аймалин белковый носитель, усиление его иммуногенности, улучшение специфичности получаемых антител.

Цель достигается тем, что получают конъюгированный антиген аймалин-белковый носитель путем ковалентного связывания аймалина с БСА, причем БСА предварительно активируют глутаровым альдегидом (ГА) при pH 9,5 в течение 2 ч, после удаления избытка ГА диализом добавляют аймалин в соотношении 1:30 и через 2 ч диализуют против фосфатного буфера pH 7,3.

Образование конъюгированного антигена происходит в результате взаимодействия карбонильной группы бифункционального реагента ГА с аминогруппой молекулы белка с образованием основания Шиффа, вторая карбонильная группа ГА реагирует с гидроксильной группой аймалина с образованием полуацеталя.

Таким образом, в предлагаемом способе в отличие от прототипа отсутствует отдельная стадия химической модификации аймалина с последующей экстракцией и перекристаллизацией продукта, что приводит к упрощению способа и значительному ускорению процесса получения антигена.

Ковалентное связывание аймалина с белком носителем подтверждается данными тонкослойной хроматографии (ТСХ). В условиях ТСХ (Silufol, Хлороформ; ацетон диэтиламин 5:4:1) конъюгат элюируется в виде единичного пятна, R_f которого меньше, чем R_f чистого аймалина, с характерными для аймалина признаками: желтой люминисценцией в УФ 354 нм и пурпурным окрашиванием при обработке концентрированной HNO₃.

Степень связывания аймалина в конъюгированный антиген контролировалась по величине УФ поглощения диализатов при 246 и 290 нм, характерного для аймалина относительно стандартного раствора аймалина. Степень связывания составляет 85% Антисыворотка, полученная при иммунизации крыс и кроликов синтезированным антигеном, имеет титры 1:4096, что подтверждает его высокую иммуногенность по сравнению с прототипом (1:3600). Полученные антитела стабильны в течение 12 мес при хранении в замороженном виде.

Предлагаемый способ получения конъюгированного антигена аймалин -белковый носитель позволяет выделить в результате иммунизации антитела высокой специфичности: процент перекрестного связывания алкалоидов, сходных по химическому строению с аймалином и также, как и он содержащихся в раувольфии, с антителами к аймалину, составляет 0,1-1,5% а с 17-о-ацетилаймалином 87% Соотношение аймалин белок (30:1) является оптимальным, поскольку полученный конъюгированный антиген стабилен во времени, не разрушается при хранении, обладает высокой иммуногенностью и достаточной специфичностью Пример 1. Получение конъюгированного антигена аймалина с БСА.

120 мг БСА растворяют в 4 мл 0,1 М карбонатно-бикарбонатного буфера (БКБ) pH 9,5; добавляют 0,1 мл 25% ГА и перемешивают 2 ч при комнатной температуре. Удаляют избыток ГА диализом против БКБ pH 9,5 и добавляют 20 мг аймалина, растворенного в 0,4 мл диоксана. Перемешивают 2 ч и отделяют белок, ковалентно связанный с аймалином, от низкомолекулярных примесей диализом против фосфатно-солевого буфера (ФСБ) pH 7,3. Диализ проводят до исчезновения УФ поглощения диализатов при 246 и 290 нм. Степень связывания конъюгированного антигена составляет 85% Пример 2. Получение конъюгированного антигена аймалина с БСА одностадийным способом.

120 мг БСА растворяют в 4 мл 0,1 М БКБ pH 9,5; добавляют 20 мг аймалина в 0,4 мл диоксана, перемешивают 30 мин при комнатной температуре и добавляют 0,1 мл 25% ГА и инкубируют 2 ч при комнатной температуре. Смесь диализуют против 0,01 М ФСБ pH 7,3 аналогично примеру 1. Степень связывания конъюгированного антигена 90% Хотя этот способ проще, полученный конъюгированный антиген менее стабилен, АТ, полученное в результате иммунизации, теряют свою активность в 1,5 раза при хранении в течение года и менее специфичны.

Пример 3. Иммунизации животных полученным конъюгатом.

Иммунизацию крыс проводят внутрибрюшинно трехкратным введением, растворяя конъюгат в физиологическом растворе и смешивая с 3 мл полного адьюванта Фрейнда. Повторные иммунизации осуществляют с неполным адъювантом через 3 недели. Кровь берут через неделю после последней инъекции и отделяют сыворотку. Кроликов иммунизируют внутривенно по схеме Ткачевой [6] Полученную сыворотку трехкратно осаждали насыщенным раствором сульфата аммония и диализовали против ФСБ pH 7,3 0,01 М.

Пример 4. Определение специфичности антител к аймалину.

Специфичность антител к аймалину изучают методом иммуноферментного анализа на полистероловых планшетах. Планшет предварительно активируют 2% раствором ГА 2 ч при комнатной температуре, после удаления несвязавшегося ГА наносят 100 мкл раствора аймалина в БКБ pH 9,5. Инкубируют 2 ч при комнатной температуре, обмывают, блокируют свободные альдегидные группы и добавляют антитела к аймалину, инкубируют 1,5 ч, отмывают и наносят антивидовой конъюгат JgG, меченных пероксидазой хрена. Добавляют субстратную смесь (ортофенилендиамин в цитратном буфере и H₂O₂) и измеряют оптическую плотность на мультискане при λ 292 нм. При изучении перекрестного реагирования вместо аймалина на планшет иммобилизуют его аналоги, сходные по химическому строению Результаты представлены в таблице.

Таким образом, предлагаемый способ получения конъюгированного антигена аймалин белковый носитель обладает целым рядом преимуществ перед прототипом, поскольку он прост, менее трудоемок и длителен, а получаемые антитела к аймалину имеют высокие титры и специфичны.

Литература 1. Ковалев И.Е. Полевая О.Ю. Биохимические основы иммунитета к низкомолекулярным химическим соединениям. М. Наука, 1985, с. 304.

2. Иммуноферментный анализ. /Под ред. Т.Т. Нго, Г. Ленхоффа. М. Мир, 1988, с. 446.

3. Егоров А.М. Осипов А.П. Дзантиев Б.Б. Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа. М. Высшая школа, 1991, с. 288.

4. Садритдинов Ф.С. Курмуков А.Г. Фармакология растительных алкалоидов и их применения в медицине. Ташкент, 1980, с. 20-23.

5. H. Arens, B. Deus-Jeumann, M.H. Zenk. Radiimmunoassay for the quantitative determination of ajmaline. Planta medica, 1987, c. 179-183.

Ткачева Т. К. Радиоиммунологический анализ. Справочник. М. Медицина, 1983, с. 32-34.

Формула изобретения

Способ получения конъюгата аймалина с бычьим сывороточным альбумином путем ковалентного связывания аймалина с бычьим сывороточным альбумином и диализа, отличающийся тем, что бычий сывороточный альбумин предварительно обрабатывают глутаровым альдегидом при pН 9,5 в течение 2 ч, диализуют, добавляют аймалин при мольном соотношении бычий сывороточный альбумин аймалин 1 30 и ковалентное связывание осуществляют в течение 2 ч.

РИСУНКИ

Рисунок 1