Способ диагностики хронического гепатита у детей

 

Использование: в области медицины, в частности в педиатрии. Сущность изобретения: определяют функциональное состояние макрофагов кожи методом гистохимического исследования при этом клетки инкубируют с аденозин-5-монофосфатом, окрашивают сульфидом аммония или натрия на 5- нуклеотидазу, по содержанию которой в цитоплазматической мембране 11,3±1,7 клеток диагностируют хронический персистирующий гепатит, а 5,3±0,4 клеток - хронический активный гепатит. Способ позволяет повысить точность диагностики и динамически оценивать эффективность проводимой терапии хронического гепатита.

Способ относится к медицине /педиатрии/, патологии клеточного иммунитета, к диагностике хронического гепатита у детей гистохимическим методом, который позволяет установить тяжесть процесса и контролировать его динамику на фоне лечения.

Известен способ /1 аналог/, позволяющий с помощью описанного комплекса патологических симптомов или клиники /Малаховский Ю.Е. в кн. под. ред. Н.И. Нисевич, Лен. "Медицина", 1981 г. "Болезни печени и желчевыводящих путей у детей", с. 249 271; Гользанд И.В. в кн. "Успехи гепатологии", Рига, 1977 г. вып. 6, с. 245 256; гл. "Течение хронического гепатита у детей"/ проследить за динамикой болезни.

Из субъективных симптомов учитываются: 1/ жалобы диспептического характера: снижение аппетита, отрыжка, плохая переносимость жиров, боли в области правого подреберья и эпигастрия, метеоризм, неустойчивый стул; 2/ жалобы астено-вегетативного характера: общая слабость, утомляемость, раздражительность, потливость, головные боли. Однако у детей младшего возраста /до 10 лет/ субъективные признаки редко выявляются.

Из объективных симптомов хронического гепатита, как правило, выявляется гепатомегалия. Печень характеризуется плотной, гладкой, чувствительной, чаще увеличенной за счет левой доли.

Селезенка в 50 60% случаев у больных выступает из-под реберной дуги на 1 3 см. Но чаще выраженная спленомегалия определяется у детей до 5 лет в случаях агрессивного гепатита.

Желтуха различной интенсивности и продолжительности обнаруживается у больных /в 25 40%/ с хронически активным гепатитом и, как правило, отсутствует при малоактивных формах.

У ряда больных отмечаются "печеночные ладони", единичные телеангиоэктазии, геморрагии /в виде редких носовых кровотечений, петехий или экхимозов/.

Следует отметить, что клинические проявления хронического гепатита очень вариабельны, индивидуальны и недостатком известного способа, исключаемого заявленным способом, является фактор субъективизма в оценке врачом клинических симптомов.

Известен способ /2 аналог/ биохимических функциональных проб, широко используемых в обследовании больных хроническим гепатитом /см. Тодоров И. "Клинические лабораторные исследования в педиатрии" София, 1966 г. Блюгер А. Ф. "Вирусный гепатит и его исходы", Рига, 1975 г./ В нем используются следующие методы: 1/ модернизированный метод Iendrassik-Kleghorn количественного определения содержания связанного билирубина к общему в В норме содержание билирубина не превышает 1,05 мг% /Предтеченский В.К. "Руководство по клиническим и лабораторным исследованиям", Медгиз, 1960 г./; 2/ метод определения активности аминотрансфераз в сыворотке крови/ Umbreitefal, 1957 г./ основан на реакции переаминирования между аланином/ для определения АлАТ/ и α кетоглютаровой кислотой. Определяется с помощью динитрофенилгидразина калориметрически образующаяся в результате этих реакций пировиноградная кислота; в норме активность АлАТ составляет 5 ед. АсАТ до 40 ед. 3/ широко распространены биуретовый и рефрактометрический методы определения общего белка, в основе которых лежит способность белков образовывать с сульфитом меди в щелочной среде комплексное соединение пурпурного цвета /см. Предтеченский В. Е. 1960 г./; в норме содержание общего белка составляет 5,7±0,7% Для определения содержания белковых фракций в сыворотке крови существует метод электрофореза на бумаге по Grassman. Hamming в модификации А.Г.Гуревича, 1955 г. В норме в сыворотке крови с помощью этого метода выделяют обычно 5 фракций: альбумины 59,7±4,5% a₁ глобулины 3,8±1,8% α₂ глобулины 6,9±2,3% β глобулины 9,7±3% и g глобулины 19,7±4% Содержание общего холестерина в сыворотке крови определяется известным методом Энгельгарда и Смирновой. Принцип основан на растворении холестерина в хлороформе, который затем дает с уксусным ангидридом и уксусной кислотой зеленое окрашивание. Содержание его в норме 180-250 мг% Определение факторов протромбинового комплекса /метод Квика/ основан на определении времени образования сгустка плазмы крови при добавлении в плазме избытка тромбопластина и оптимального количества кальция / Тодоров И. 1966 г/. В норме показатели его колеблются в пределах 70-110% К недостаткам известного способа, исключаемого заявленным способом, относятся: необходимость забора крови из вены в большом количестве, многоэтапность методик, необходимость сложной аппаратуры с большим количеством реактивов, специальная подготовка персонала. Кроме того, известный способ дает маловероятный анализ и прогноз заболевания. Перечисленные способы схематичны и лишь приближенно дают представление о патологическом процессе в печени, в котором основным моментом патогенетически является реакция иммунной системы.

Наиболее точную информацию о состоянии патологического процесса при хроническом гепатите можно получать с помощью прижизненного морфологического исследования ткани печени, главным образом, методом пункционной биопсии печени [1] А.Ф. Блюгер "Вирусный гепатит и его исходы", Рига, 1970 г. с.272-279.

После тщательного обследования, для исключения противопоказаний, у больного определяется количество тромбоцитов, свертывание крови, время кровотечения, протромбиновый комплекс. Операция пункционной биопсии у детей осуществляется следующим образом /Ю.И.Богомазов "Пункционная биопсия печени у детей", дисс. канд. 1965/. Ребенок укладывается на операционный стол в положении на спине; ему дается масочный наркоз и парентерально вводятся миорелаксанты, обеспечивающие отключение дыхательных движений на момент пункции печени. В период апное ребенку в области 9 межреберья справа по среднеподмышечной линии делается прокол кожи и в полученное отверстие вводится пункционная игла и извлекается столбик печеночной ткани. Сразу же взятый кусочек печени должен быть помещен в фиксирующий раствор /10% формалин или фиксатор Лилли/ и без промедления доставлен в патологоанатомическое отделение, где осуществляется дальнейшая обработка биопсированного материала. Для этого полученный кусочек печени проводится через спирты, заливается в парафин. Далее из парафинового блока приготовляются срезы ткани, депарафинируются и последовательно окрашиваются стандартными красителями /гематоксилин-эозином по Ван-Гизону и т.д./. На последнем этапе специалист-патологоанатом просматривает препараты и дает заключение о состоянии патологического процесса в печени.

К недостаткам данного метода, устраняемого заявленным способом, относятся необходимость осуществлять пункционную биопсию печени в условиях специализированного хирургического стационара при наличии хорошо оборудованной операционной и специально обученного персонала высокой квалификации: хирурга и анестезиолога. Это может быть доступно только лишь отдельным центральным клиникам страны. Кроме того, пункция печения является оперативным вмешательством и, с учетом даваемого наркоза, расценивается как небезопасная манипуляция. С биопсией печени связаны известные осложнения, которые в редких случаях могут иметь место: кровотечения из места пункции, инфицирование плевры и брюшной полости, повреждение соседних органов. Поэтому после пункции больной в течение 24 часов находится на постельном режиме с обязательным контролем за общим состоянием, артериальным давлением и пульсом. Следует помнить о том, что при пункции не всегда удается добыть ткань печени, и может быть безрезультатная пункция, а в 2-15% возможна и "сухая" пункция (А. Ф. Блюгер "Вирусные гепатиты и его исходы", Рига, 1970 г. с.272 279). Наконец, следует учитывать значительную продолжительность времени от момента пункции до получения морфологического заключения специалиста-патологоанатома /оно составляет от 3 до 10 дней/. Важным недостатком является невозможность проведения этого исследования с необходимой частотой в динамике на фоне лечения.

Основной задачей /целью/ заявленного изобретения является динамическая оценка тяжести патологического процесса при хроническом гепатите у детей на фоне проводимой терапии.

Дополнительной целью является безопасность заявленного способа для жизни больного /кожная скарификационная проба с малой травматизацией ребенка/.

Решение этой задачи достигается /в отличие от прототипа/ тем, что в предлагаемом способе исключается дача наркоза, забор пунктата, гистологическая обработка и оценка пунктата, а проводится поверхностная скарификация кожи на передней поверхности предплечья в верхней трети, предварительно обработанной этиловым спиртом. Скарификатором снимается участок эпидермиса размером 0,5x0,5 см без повреждения дермы и ее капилляров. Ранку покрывают стерильным стеклом, которое фиксируется лейкопластырем, и экспонируют его в течение 24 часов. Полученный отпечаток экссудата клеток на стекле высушивают и фиксируют в парах формалина, затем помещают в инкубационную среду на 30 минут при температуре 37^oС, состоящую из аденозин-5-монофосфата /30 мг/, 0,1 М ацетатного буфера pH 5,6; 0,1 М раствора нитрата свинца /1 мл/. После инкубации и промывки препарат помещается на 2 мин в 5% раствор сульфида аммония или натрия. После промывки и высушивания микроскопируется с иммерсией. В полях зрения фиксируется макрофагальные клетки с коричневой или черной окраской цитоплазматической мембраны, свидетельствующей о фиксации активности эктофермента 5-нуклеотидазы, отражающем состояние активации нормально функционирующих в зоне воспаления макрофагов. В норме в среднем количество макрофагов, насыщенных этим эктоферментом, составляет 23±5,4 положительно окрашенных клеток.

Заявленным способом обследовано 89 детей в возрасте от 1 года до 14 лет, страдающих хроническим гепатитом. Выделены 2 группы больных с достоверно различным содержанием макрофагов, насыщенных 5-нуклеотидазой. Каждой из групп соответствовал определенный вариант воспалительного процесса в печени по данным пункционной биопсии печени.

В 1 группе больных /20 чел./, в основном с хроническим персистирующим гепатитом /ХПГ/ и упорным выделением HBsAg, либо анти-HCV /маркеров вирусов B или C гепатитов/, с малосимптомностью клинической картины, содержание макрофагов в зоне асептической воспалительной реакции в коже /АВР/ с активностью в их цитоплазматической мембране 5-нуклеотидазы в среднем составляло 11,3±1,7 /положительно окрашенных клеток/.

В пунктатах печени характерным для этой группы больных были умеренно выраженные инфильтративные и дистрофические проявления без значительных деструктивных изменений паренхимы печени. Отмечался умеренный фиброз в области портальных трактов, сочетавшийся с умеренной лимфоцитарной и макрофагальной инфильтрацией.

Таким образом, у больных с вялотекущим хроническим гепатитом выявлялось умеренное снижение активности 5-нуклеотидазы, что, в свою очередь, свидетельствовало о функциональной неполноценности этих клеток в механизмах элиминации вирусных антигенов и передаче антигенной информации другим иммунокомпетентным клеткам.

Во второй группе больных /69 детей/ с хроническим активным гепатитом, в которой клинические проявления болезни были более манифестными, что выражалось наличием у всех больных гепатолиенального синдрома, а в 40-50% отмечались астено-вегетативный и геморрагический синдромы. Кроме того, имели место внепеченочные проявления в виде пальмарной эритемы, телеангиоэктазий, а в биохимических тестах гипербилирубинемия, гиперферментемия и диспротеинемия.

В этой группе больных фиксировалось более глубокое угнетение функциональной активности макрофагов, что выражалось уменьшением их количества до 5,3±0,4 с положительным окрашиванием на 5-нуклеотидазу. Отличительным морфологическим вариантом пунктатов печени данной группы детей было то, что они характеризовались деструктивными явлениями с разрушением пограничной пластинки и накоплением значительных перипортальных инфильтратов из лимфогистиоцитарных и макрофагальных инфильтратов с наличием плазматических клеток и активных фибробластов; резко выраженным было разрастание соединительной ткани в портальных трактах с внедрением ее с клеточными инфильтратами внутрь дольки. У части детей с высокой активностью процесса выявились в большом количестве ступенчатые некрозы.

Таким образом, данная группа характеризовалась параллелизмом между глубиной патологического процесса в печени со степенью угнетения функциональной активности и деградации макрофагальных клеток.

Пример: Больной Гудков А, 8 лет; история болезни N 656; от 1 нормально протекавших беременности и родов, весом 3 кг; с 6 мес. возраста получал множественные парентеральные манипуляции с введением препаратов крови в связи с пневмонией, а с 2,5 лет в связи с нефрэктомией и несколькими курсами химиотерапии по поводу нефробластомы. С 7 лет появились жалобы на боли в эпигастральной области и правом подреберье, которые в течение полугода имели тенденцию к усилению. При обследовании в диагностическом центре РДКБ диагностировали гастродуоденит, панкреатит, дисбактериоз; кроме того, на фоне гепатомегалии выявились гиперферментемия и в ИФА-методе выявлены маркеры гепатитов B и C /HBsAg, HBeAg, анти-HCV/. Для уточнения характера поражения печени и решения вопроса о тактике лечения поступил в нашу клинику /кафедра детских инфекций РГМУ/. Состояние при поступлении средней тяжести, выражены проявления астено-вегетативного синдрома, внепеченочные знаки в виде пальмарной эритемы и экхимозов. Болезненность в эпигастральной области, увеличена печень до 2x2xв /3 ниже реберного края и уплотнена, пальпировалась селезенка на 1 см ниже реберного края. По данным УЗИ брюшной полости печень разноплотна и значительно уплотнена в перипортальной зоне. Желчный пузырь с перетяжкой и S-образной деформацией. Увеличена селезенка. В биохимии крови от 29.5.92/при поступлении/: белок общ. 71 г/л, АлАТ 155 ед. АсАТ 83 ед. /при норме до 40 ед./, холестерин 4,17 ммоль/л /норма 3,7 6,5/.

В иммунологическом статусе: от 2/6-93 г. ОКТ₃ -38% ОКТ₄ - 19% ОКТ₈ 18% /норма/; в зоне АВР макрофагов 0% /хемотаксис/, в связи с чем определение 5-нуклеотидазы было невозможно.

В анализах крови, мочи, по остальным органам без патологии.

Пункционная биопсия печени N445 от 25/6-92 г. хронический активный гепатит умеренной активности.

С учетом активности процесса в печени, а также репродуктивной фазы HB-вирусной и HC-вирусной инфекций назначен был курс реаферона в виде свечей в течение 3-х мес. который обладает помимо противовирусного действия иммуномодулирующим эффектом. Спустя 3 мес. при обследовании по катамнезу: жалоб нет, печень у реберного края стала менее плотной; селезенка не увеличена. В биохимическом анализе крови /от 2/11-92 г/АлАТ и АсАТ 90 ед. /норма до 40 ед./, т. е. данные клинического осмотра и функциональных проб печени свидетельствовали о наступлении неполной ремиссии процесса. Этот период характеризовался улучшением показателей функционального состояния макрофагов, характеризовавшихся улучшением миграционной активности этих клеток /хемотаксис составлял 29,6% при норме 75%/, а в полях зрения определялось 6 клеток, насыщенных 5-нуклеотидазой. В дальнейшем спустя 6 мес. после лечения наступила сероконверсия HBeAg на анти-HBe, свидетельствующая об улучшении фагоцитарной активности этих клеток и включении механизмов элиминации вирусных антигенов. Данный пример свидетельствует о ценности предлагаемого метода как в оценке и прогнозе глубины патологического процесса в печени при хроническом гепатите, так и для оценки эффекта от проводимой противовирусной и иммуномодулирующей терапии (реафероном).

Положительный эффект от применения заявленного способа для больного заключается в том, что контроль за динамикой тяжести патологического процесса в печени позволяет установить определенные сроки терапии, благодаря этому сократить время реабилитации, устранить побочное влияние терапии и своевременно остановить прогрессирование патологического процесса в печени, опережая получение результатов повторной биопсии печени (прототип), которая для больного травматична и опаснее для жизни, чем заявленный способ.

К недостаткам клинической оценки текущего патологического процесса (1 аналог), исключаемого заявленным способом, относятся малосимптомность в ряде случаев /как при ХПГ, так и при ХАГ/, а также субъективизм врача в оценке симптомов.

Биохимические методы оценки текущего патологического процесса /2 аналог/ не дают, в сравнении с заявленным способом, достаточной продолжительности прогноза /т.к. регистрируют лишь слабо выраженный синдром цитолиза в период высокой активности патологического процесса непосредственно в печени. Кроме того, показатели биохимических тестов могут быть нормальными даже при активно текущем процессе в печени у больных с хроническим гепатитом.

Базовый иммунологический способ оценки функционального состояния печени /Т. В. Чередниченко, Бюл. N 44 УДК 616.36.002.1.059.31/088.8 оупбл. 30.11.85 г. /, где по уровню снижения хемотаксиса макрофагов в зоне асептического воспаления в коже судят о глубине патологического процесса в печени, в ряде случаев (даже при циррозе печени) этот показатель остается нормальным. В то же время в заявленном способе на фоне нормальных показателей хемотаксиса макрофагов выявляется резкое угнетение активности 5-нуклеотидазы в цитоплазматической мембране этих клеток, которое коррелирует с глубиной патологического процесса в печени. Таким образом, существенным отличием заявленного способа от базового иммунологического является его более высокая точность.

Формула изобретения

Способ диагностики хронического гепатита у детей путем исследования клеток, отличающийся тем, что контактным методом получают препарат клеток макрофагов кожи, инкубируют с аденозин-5-монофосфатом, окрашивают сульфидом аммония или натрия на 5-нуклеотидазу, по наличию которой в цитоплазматической мембране этих клеток определяют функциональное состояние макрофагольного звена иммунитета и по содержанию ее в 11,3 ± 1,7 клеток диагностируют хронический персистирующий гепатит, а в 5,3± 0,4 клеток хронический активный гепатит.