Способ получения иммуносорбента для диагностики вирусного гепатита с

 

Использование: медицина, вирусология, для получения иммуносорбента для диагностики вирусного гепатита C. Сущность изобретения: носитель обрабатывают вирусспецифическим белком, инкубируют обработанный носитель при температуре +4^oC с последующей отмывкой избытка белка и высушиванием полученного иммуносорбента, при этом в качестве носителя используют полимерный носитель, в качестве вирусспецифического белка используют белок, продуцируемый рекомбинантным штаммом E.coli, в виде раствора с концентрацией 0,5 - 5 мкг/мл обработанный носитель инкубируют в течение 1 - 24 ч, а после отмывки и высушивания носитель дополнительно обрабатывают 10% раствором осветленной сыворотки крупного рогатого скота или 5 - 7% раствором обезжиренного молока. Способ прост, позволяет повысить чувствительность определения антител к вирусу гепатита C и получать иммуносорбент со сроком хранения более шести месяцев.

Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может найти применение для совершенствования диагностики вирусного гепатита C.

Известен способ получения носителя для иммунодиагностики (а.с. СССР N1620939, 1991, МПК: G 01 N 33/543), в котором получают окрашенные полиакролеиновые частицы, сенсабилизированные гамма-глобулинами.

Однако полученная таким образом иммунодисперсионная система обладает низкой устойчивостью при хранении. В связи с этим приготовление медицинских диагностикумов на основе подобных носителей требует дополнительной стабилизации для увеличения их срока хранения.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является принятый за прототип способ приготовления полимерного носителя для иммунодиагностики "Способ получения имменосорбента" N 1517545, кл. G 01 N 33/53Ю.

Этот способ заключается в обработке полимерного носителя антигеном с последующей отмывкой избытка белка и высушиванием иммуносорбента.

Недостатком этого способа является то, что он предназначен только для одного типа полимерного носителя, а также не позволяет изготовлять иммуносорбент со сроком хранения более шести месяцев. Следует также отметить, что условия приготовления иммуносорбента оставляют возможность для неспецифического связывания компонентов реакционной смеси.

В основу изобретения положена задача создания такого способа, который позволяет повысить чувствительность определения антител к вирусу гепатита C в сыворотках крови больных и доноров крови, а также снизить количество ложноположительных реакций.

Кроме того, полученный по предлагаемому способу иммуносорбент с иммобилизованным антигеном сохраняет высокую специфическую активность более одного года.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе получения иммуносорбента для иммунодиагностики вирусного гепатита C на основе полимерного носителя путем обработки раствором вирусспецифического рекомбинантного антигена с проявлением в иммуноферментной реакции раствор антигена в концентрации 0,5 5 мкг/мл наносят на полимерный носитель и инкубируют в течение 1 24 ч, после чего избыток антигена удаляют и подвергают полимерный носитель высушиванию. После удаления раствора и высушивания полимерный носитель обрабатывают 10% раствором осветленной сыворотки крупного рогатого скота или 5 7% раствором обезжиренного молока.

Вирусспецифический антиген получают предварительно путем культивирования рекомбинантного штамма E.coli с последующим разрушением клеток, отделением растворимой фракции и очисткой белка ионообменной хроматографией. Контроль чистоты препарата проводят электрофоретически.

Способ реализуют следующим образом.

Пример 1. В качестве антигена используют белок, продуцируемый клетками рекомбинантного штамма E.coli 109/pFc-105-302 (генотип HB 101), которым активируют полимерный носитель полистироловые планшеты. Раствор антигена вируса гепатита C в концентрации 0,5 мкг/мл в карбонатном буфере 0,05 M, pH 9,6. По 100 мкл раствора вносят при комнатной температуре в лунки полимерного планшета. Планшеты закрывают крышкой и инкубируют в течение 20 ч при температуре +4^oC. Перед проведением анализа избыток антигена удаляют и промывают планшет фосфатным буфером, pH 7,4 с добавлением 0,05% Твин-20. Планшеты с иммобилизованным антигеном высушивают на воздухе при температуре 20 22^oC в течение 4 ч, после чего их герметично запаивают в полиэтиленовые пакеты.

Для снижения неспецифической сорбции на носителе после удаления раствора и высушивания его обрабатывают 10% раствором осветленной сыворотки крупного рогатого скота.

Пример 2. В качестве антигена используют белок, продуцируемый клетками рекомбинантного штамма E.coli 109/pFc-105-302 (генотип HB 101), как в примере 1. Раствор антигена вируса гепатита C в концентрации 1 мкг/мл в карбонатном буфере 0,05 M, pH 9,6, по 100 мкл вносят при комнатной температуре в лунки полимерного планшета. Планшеты закрывают крышкой и инкубируют в течение 24 ч при температуре +4^oC. Перед проведением анализа избыток антигена удаляют и промывают планшет фосфатным буфером, pH 7,4 с добавлением 0,05% Твин-20.

Планшеты с иммобилизованным антигеном высушивают на воздухе при температуре 20 22^oC в течение 4 ч, после чего их герметично запаивают в полиэтиленовые пакеты.

Пример 3. Антиген в концентрации 5 мкг/мл, 2,5 мкг/мл и 1,25 мкг/мл в фосфатном буфере иммобилизуют на поверхность полимерного носителя - нитроцеллюлозного фильтра, внося в пятно по 50 мкл раствора. Избыток антигена удаляют. Фильтр высушивают на воздухе. Для снижения неспецифической сорбции на носителе после удаления раствора и высушивания его обрабатывают 5 7% раствором обезжиренного молока.

Иммуносорбент (носитель с иммобилизованным антигеном) высушивают на воздухе в течение 16 ч, после чего он готов для проведения иммуноферментного анализа и может сохраняться не менее одного года.

Формула изобретения

Способ получения иммуносорбента, включающий обработку носителя вирусспецифическим белком, инкубирование обработанного носителя при температуре +4^oС с последующей отмывкой избытка белка и высушиванием полученного иммуносорбента, отличающийся тем, что для диагностики вирусного гепатита С в качестве носителя используют полимерный носитель, в качестве вирусспецифического белка используют белок, продуцируемый рекомбинантным штаммом E.coli, в виде раствора с концентрацией 0,5 5,0 мкг/мл, обработанный носитель инкубируют в течение 1 24 ч, а после отмывки и высушивания носитель дополнительно обрабатывают 10%-ным раствором осветленной сыворотки крупного рогатого скота или 5 7%-ным раствором обезжиренного молока.