Способ иммуноанализа биологически активных веществ

 

Изобретение относится к биотехнологии , а именно к способу проведения иммуноферментного анализа, и может быть использовано для определения биологически активных веществ. Цель изобретения - упрощение анализа. Сущность изобретения: к исследуемому образцу добавляют антитела , иммобилизованные на полиметакриловой кислоте, и конъюгат антитела (антигена) с ферментом. После образования растворимых иммунокомплексов раствор приводят во взаимодействие с нерастворимым положительно заряженным носителем. Ферментативную активность определяют на поверхности полимера или в элюате, полученном элюцией с поверхности полимера связавшихся компонентов. Положительный эффект. Анализ непродолжителен и прост, предполагает возможность использования малых проб, содержащих антиген, что делает его практичным и эффективным . ел

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)ю G 01 N 33/543

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОспАтент cccpl «» >v li:РЯД 1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ

О !

Ю (21) 4855423/14 (22) 31.07.90 (46) 07.03.93. Бюл. ¹ 9 (71) Институт иммунобиотехнологии (72) А,П.Осипов, Б,М.Горовиц, ЕЛ.Горовиц, А, Ф,Духович, Б, Б,Дзантиев и В,А, Изумрудов (73) Институт иммунобиотехнологии (56) Иммуноферментный анализ, Ред, Т,Т.Нго. Г.Ленхофф, М.; Мир, 1988, с.444.

Laboratory techniques in biochemistry

and molecular biology. Practice and theory of

enzyme immunoassays. P. Tijssen, ed., York.

N 4, 1985, рр.549, (54) СПОСОБ ИММУНОАНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ (57) Изобретение относится к биотехнологии, а именно к способу проведения иммуноферментного анализа. и может быть

Изобретение относится к области биотехнологии, точнее к способам иммуноферментного определения биологически активных веществ.

Целью изобретения является упрощение процесса.

Способ осуществляют следующим образом. К исследуемому образцу добавляют антитела, ковалентно иммобилизованные на водорастворимом полианионе или поликатионе, например, полиметакриловой кислоте (ПМАК), и конъюгат антител (антигенов), меченных ферментом, при этом в растворе одновременно протекают реакции: связывания иммобилизованных антител с антигеном и мечеными антигенами (антителами).

После образования растворимых иммунокомплексов раствор приводят в контакт с

„„Я „„1801214 А3 использовано для определения биологически активных веществ. Цель изобретения— упрощение анализа, Сущность изобретения: к исследуемому образцу добавляют антитела, иммобилизованные на полиметакриловой кислоте, и конъюгат антитела (антигена) с ферментом. После образования растворимых иммунокомплексов раствор приводят во взаимодействие с нерастворимым положительно заряженным носителем. Ферментативную активность определяют на поверхности полимера или в элюате, полученном элюцией с поверхности полимера связавшихся компонентов. Положительный эффект. Анализ непродолжителен и прост, предполагает возможность использования малых проб, содержащих антиген, что делает его практичным и эффективным. нерастворимым положительно заряженным носителем (полимером), вследствие чего компоненты, связанные с иммобилизованными антителами,адсорбируются на носителе в результате кооперативных ионных взаимодействий между молекулами отрицательно заряженного полианиона, содержащего иммунокомплекс анти гена с меченными ферментом антителами, и положительно заряженной матрицей. После промывания носителя с целью удаления неспецифически связавшегося конъюгата антител с ферментом на него наносят раствор субстрата фермента и количественно измеряют концентрацию продукта, которая пропорциональна концентрации определяемого антигена и служит характеристикой его содержания в исследуемом растворе.

1801214

Концентрацию антигена в исследуемом образце определяют с помощью калибровочного графика, полученного при использовании стандартных препаратов, Если в качестве носителя используют положительно заряженную мембрану, а продукт ферментативной реакции является водонерастворимым и удерживается на мембране, то детекцию можно проводить визуально.

В качестве положительно заряженных нерастворимых полимеров могут быть использованы пористые матрицы (например, нитроцеллюлозные, ацетатцеллюлозные и др. мембраны), на которых предварительно был адсорбирован поликатион (например, поли-4-винил-пиридинийбромид (ПВП), хитозан, полиэтиленимин и др,); заряженные вследствие наличия ионогенных групп матрицы (например, ДЕАЕ-целлюлоза, ДЕ-бумага, DEAE-Sephacel и др,) и т.д, Детекция ферментативной активности может вестись как непосредственно на матрице, так и в смывах активных компонентов с нее, Применение в первом случае субстратных систем, образующих в результате ферментативной реакции нерастворимый . продукт, позволяет проводить визуальную оценку результата анализа. Визуальная регистрация окраски поверхности пористого носителя (в отраженном свете, а не на про- 30 пускание, как это имеет место при сравнении окраски жидких образцов в способе-прототипе) позволяет с большей точностью проводить сравнение получаемых образцов со стандартами. С другой стороны, обратимость ион-ионного взаимодействия при высоких значениях ионной силы позволяет многократно использовать нерастворимый положительно заряженный полимер, элюируя с него свя- 40 завшиеся компоненты и измеряя ферментативную активность в элюате.

Пример 1. Анализ иммуноглобулинов

G (1gG) человека. В качестве антител используют у -глобулиновую фракцию кроличьей 45 антисыворотки против 1gG-человека, дополнительно очищенную ионосфменной хроматографией на DEAE-Sephacel, Иммуносорбенты на основе полиметакриловой кислоты .(ПМАК) с молекулярной массой 200 000 получают ковалентным связыванием антигенов или антител с ПМАК, используя в качестве сшивающих агентов водорастворимые карбодиимиды (1-этил3(3-диметиламинопропил)-карбодиимид 55 гидрохлорид или 1-циклогексил-3-(2-морфолино-4-атил)-карбодиимид и-толуол-фосфат) совместно с N-оксисукцинимидом.

B качестве антигена используют коммерческий препарат lgG человека.

В качестве фермента используют пероксидазу хрена с PZ = 3,0 (ПХ), Конъюгат IgG человека с пероксидазой (ПХ/ЕС1.11.1.7) получают методом окисления углеводного компонента фермента периодатом натрия.

Нерастворимый заряженный полимер готовят следующим образом. Нитроцеллюлозные фильтры производства фирмы "Симпор" инкубируют в 1х10 M растворе поли-4-винил-пиридинийбромида (ПВП) с молекулярной массой 80000 в калий-фосфатном буфере рН 7,2 (КФ Б) в течение 1 часа при комнатной температуре, Затем фильтры блокируют 3 -ным раствором бычьего сывороточного альбумина в КФБ в течение 1 часа при комнатной температуре.

В серию инкубационных пробирок, содержащих 1gG человека в концентрациях

1х10, 5х10, 2х10, 1х10, 5х10

2x10 M в 0,01 калий-фосфатном буфере рН 7,2, 0,05 Твин-20, 0,15M NaCI, добавляют 0,1 мл раствора конъюгата IgG-пероксидаза (1х10 М), Затем в пробирку

-11 добавляют 0,1 мл раствора иммуносорбента (1х10 М), инкубируют 5 минут при комнатной температуре, Разделение компонентов раствора проводят, пропуская его через нитроцеллюлозный фильтр с иммобилизованным ПВП, Детекцию ферментной метки на фильтре ведут инкубацией его в растворе субстратов, содержащем 3,3 -диаминобензидин (0,5 мг/мл), перекись водорода 1х10 M и добавки солей кобальта (0,2 ).

Определение концентрации измеряемого IgG проводят по интенсивности окрашивания фильтра по калибровочному графику, полученному со стандартными препаратами 1ц6. Чувствительность метода — 5х10 М. время анализа — 10 минут.

-11

Пример 2. Анализ HBS-антигена, В качестве антител используют у -глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки против HBS-антигена.

Иммуносорбент, конъюгат lgG, специфический к HBS-антигену и нерастворимый заряженный полимер получают, как в примере 1.

B качестве антигена используют коммерческий препарат HBS-антигена, В серию инкубационных пробирок,,содержащих HBS-антиген в концентрациях

320, 160, 80, 40, 20, 10, 5, 2,5 и 1,25 нг/мл в

0,01 калий-фосфатном буфере рН 7,2, 0,057;

Твин-20, 0,15М NaCI, добавляют 0,1 мл раствора конъюгата IgG-пероксидаза (1x10 "М).

Затем в пробирку добавляют 0,1 мл раствора иммуносорбента (1х10 М), инкубируют 5 минут при комнатной температуре.

1801214 ным раствором бычьего сывороточного альбумина в КФБ в течение 1 часа при комнатной температуре, В серию инкубационных пробирок, содержащих пероксидазу в 0,01 калий-фосфатном буфере рН 7,2, 0,05 Твин-20, 0,15М NaCI, добавляют 0,1 мл раствора иммуносорбента (5x10 М), инкубируют 5 минут при комнатной температуре, Далее способ осуществляют как в примере 1.

Чувствительность метода — 10 М, время анализа 10 мин.

Таким образом предлагаемый способ экспресс-анализа по чувствительности сопоставим с твердофаэными методами ИФА, В то же время гомогенность аналитической системы позволяет сократить количество стадий, увеличить точность и воспроизводимость анализа, Составитель А.Осипов

Техред М.Моргентал Корректор Л.Пилипенко

Редактор С.Кулакова

Заказ 1190 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент". г. Ужгород. ул.Гагарина. 101

Далее способ осуществляют как в примере 1, Чувствительность метода — 2,5 нг/мл, время проведения анализа 10 мин, Пример 3. Анализ тироксина, В 5 качестве антител используют у -глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки против тироксина.

В качестве антигена используют коммерческий препарат тироксина. 10

Иммуносорбент и конъюгат тироксина с пероксидазой получают, как в примере 1.

В качестве нерастворимого заряженного полимера используют ДЕАЕ-бумагу.

Предварительно носитель блокируют в 3 15 растворе бычьего сывороточного альбумина в КФБ в течение 1 часа при комнатной температуре, В серию инкубационных пробирок, содержащих. тироксин в концентрациях 50, 20

150, 300, 500 нг/мл в 0,01 калий-фосфатном буфере рН 7,2, 0,05 Твин-20, 0,15М йаС1, добавляют 0,1 мл раствора конъюгата тироксин-пероксидаза (60 нг/мл), Затем в пробирку добавляют 0,1 мл раствора имму- 25 носорбента (1х10 М), инкубируют 5 минут при комнатной температуре.

Разделение компонентов раствора проводят, пропуская его через блокированную

ДЕАЕ-бумагу. Далее способ осуществляют 30 как в примере 1, Чувствительность метода — 150 нг/мл, время анализа 5 мин.

Пример 4. Анализ пероксидазы в качестве антигена, В качестве антител ис- 35 пользуют у -глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки против пероксидазы, Иммуносорбенты получают как в примере 1, В качестве антигена используют фер- 40 мент — пероксидазу хрена с R2 = 3,0 (ПХ).

В качестве нерастворимого заряженного полимера используют ДЕАЕ-Sephacel, Предварительно носитель блокируют З Формула изобретения

Способ иммуноанализа биологически активных веществ, включающий добавление в исследуемый образец меченных ферментом антигенов или антител и

Специфических антигенов или антител, иммобилизованных на водорастворимом полианионе или поликатионе, разделение компонентов иммунологической реакции с помощью противоположно заряженного полимера и последующее определение ферментативной активности, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью упрощения способа, для разделения компонентов иммунологической реакции используют нерастворимые, заряженные полимеры, при этом реакционный раствор приводят сначала в контакт с нерастворимым заряженным полимером, затем с субстратным раствором и определяют ферментативную активность на поверхности полимера или в элюате, полученном элюцией с поверхности полимера связавшихся компонентов.