Способ диагностики аутоиммунного поражения миокарда при миокардитах

 

Изобретение относится к области медицины, а именно к изучению аутоиммунных поражений сердца. Цель изобретения - повышение точности способа. У больного производят забор крови, выделяют из нее сыворотку, которую инкубируют в присутствии нитроцеллюлозной мембраной с фиксированными к ее поверхности мембранной фракцией кардиомиоцитов. И при выявлении иммунопреципитата. содержащего белок с мол. м. 67 KD, диагностируют аутоиммунное поражение миокарда. По сравнению с прототипом увеличивается точность способа на 25%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (51)5 G 01 N 33/543

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ )»

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)

I.

ОЛИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

» !

1, ОО

1 !

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4770495/14 (22) 15.12.89 (46) 07,12,92. Бюл. М 45 (71) Центральная научно-исследовательская лаборатория Четвертого главного управления при Министерстве здравоохранения

СССР (72) Ю. И,Зимин, Ю.В. Котел евцев. С. Е,Терещенко и С.Л.Рязанов (56) Kleinretal, Clin Ехр. Immunol, 1984, v,58, р.283-292. (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ АУТОИММУННОГО ПОРАЖЕНИЯ МИОКАРДА ПРИ

МИОКАРДИТАХ

Изобретение относится к области медицины, а именно к изучению аутоиммунных заболеваний сердца.

Целью изобретения является повышение точности способа, Способ осуществляют следующим образом.

Получают препарат белков мембран кардиомиоцитов методом ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахарозы с последующим злектрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Для этого 70 г сердечной мышцы на льду измельчают ножницами и гомогенизируют в 500 мл 10 мМ раствора

4-морфолинпропансульфата (МПС) CI буфера (рН вЂ” 7,4), содержащего 10 М фенилметилсульфанилфторид, по 50 мл ножевым гомогенизатором при максимальной скорости оборотов. Все операции выделения проводят при 4 С. Гомогенат фильтруют через

2 слоя марли и центрифугируют в течение 10 мин при 3500 оборо гов в минуту (ротор Т:21) „„. Ж„„1780007 А1 (57) Изобретение относится к области медицины, а именно к изучению аутоиммунных поражений сердца. Цель изобретения — повышение точности способа. У больного производят забор крови, выделяют из нее сыворотку, которую инкубируют в присутствии нитроцеллюлозной мембраной с фиксированными к ее поверхности мембранной фракцией кардиомиоцитов. И при выявлении иммунопреципитата, содержащего белок с мол. м. 67 KD, диагностируют аутоиммунное поражение миокарда. По сравнению с прототипом увеличивается точность способа на 25%. на центрифуге "Вескп ап" L4-40.

Супернатант. отбирают и центрифугируют в течение 40 мин при 20000 оборотах в минуту. Осадок ресуспендируют в 150 мл 0,6 MM раствора KI и 10 MM раствора MllC, а затем экстрагируют в течение 2 ч при слабом перемешивании. После этого проводят центрифугирование в течение 40 мин при 20000 оборотах в минуту, Осадок ресуспендируют в 30 мл 8%-ного раствора сахарозы и 10 мМ раствора МПС, после чего наносят супернатант на ступенчатый градиент плотности сахарозы 17%, 35% и 45%, центрифугируют в течение 2 ч при 25000 оборотах s минуту (ротор — 27, .Клеточные мембраны, флотирующие на интерфазах 17-35%, 35-45%, собирают, ресуспендируют в 10 мМ растворе

МПС, после чего проводят анализ электрофорезом. Электрофорез проводят в градиенте 5-15% полиакриламидного геля.

Образцы, содержащие 5-6 мг/мл белка, солюбилизируют, добавляя 1/5 часть буфера (10% íûé раствор додецил-сульфата на1780007 использовали сыворотку крови с высоким титром антител к миокарду, в качестве отрицательного — сыворотку крови донора. Результаты показали наличле антител против белка мембраны кардиомиоцитов с мол>массой 67 кД, что свидетельствует об аутоимlëóнной природе поражения миокарда.

Формула изобретения

Способ диагностики аутоиммунного пора>кения миокарда при миокардитах, включающий забор крови, выделение сыворотки, инкубацию ее с антигеном MMOKGDäà, выявПример I, Исследовали сыворотку крови больного с миокардитом ревматической природы, диагноз которого поставили на основании клиники, ревмотестов, а также данных инструментального обследования, включая эндомиокардиальную биоление иммунопреципитатов, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения псию, В качестве положительного контроля точности способа в качестве антигена истрия, 50 м1Л раствор Трис, 0,2%-ный раствор бета-меркаптоэтанол). Прогревают B течение 5 мин при 95 С и центрифугируют в течение 20 мин при 20000 оборотах в минуту. После добавления 10%-ного раствора глицерина и бромфенолового синего наносят 50 мкг белка мембран кардиомиоцитов на дорожку или 2 мг в 300 мкл на пластинку

20х10 см, залитую препаративной гребенкой, Проводят электрофорез при пос;-оянном напряжении 100 В в течение 3,5 ч.

Для получения диагностических полосок переносят белок мембран кардиомиоцитов на нитроцеллюлозу методом иммуноблоттинга при охлаждении с напряженностью электрического поля 25 В/см, силе тока

0,45 А в течение 1,5 ч на приборе ТгansВ!от (фирма В!о-Rad) в буфере (192 мМ глицин, 25 м v1 Трис HCI, 20% метанол) fpH—

8,3).

Определение антител к миокарду в сыворотке крови больного осуществляют 10сле блокирования полос нитроцеллюлозы путем инкубации при комнатной температуре в 3% растворе желатина в течен ле 40 минут. После этого осуществляют инкубацию этих полос с исследуемыми сывороткамл крови больных в разведении 1;50 — 1 .100, положительным контролем — сыворотками крови больных с высоким титром искомых антител, отрицательным контролем — сыворотками крови доноров в 500 мУ растворе

NaCl, 50 M Трис, 0,5 / Tween-20(А), содержащем 1 р желатина, в течение 2-12 ч, Проводят 3 основных отмывки буфером А по 20 мин каждая. После этого осуществляют инкубацию с меченными пероксидазой кроличьими антителами против иммуноглобулинов человека в разведении

I:400 в течение 2 ч. Проводят 3 отмывки в течение 20 мин каждая. Проявление осуществляют с хлоронафтолом до появления слабого окрашивания на контрольных образцах.

Если первые 2 этапа (получение белков мембран кардиомиоцитов и прлготовление диагностикума) осуществляют в условиях специализированного производства, то 3 этап (собственно выявление антител к белкам мембраны кардиомиоцитов) можно проводить в любом учреждении практического здравоохранения.

Пример 2. Исследовали сыворотку крови больного миокардитом типа Фидлера. Диагноз заболевания поставили на основании клинического течения, данных лабораторного и инструментального обследования, включая эндомиокардиальную биопсию. В качестве поло>кительного контроля использовали сыворотку крови с высокими титрами искомых антител к миокарду, отрицательного — сыворотку крови донора.

Результаты позволили сделать заключение о наличии антител против белка мембраны кардиомиоцитов с мол,массой 67 кД в сыворотке KpoElvl данного больного, что свидетельствовало об аутоиммунном поражении миокарда у данного больного.

Способ апробирован на 30 донорах, 20 больных миокардитом, 10 больных дилатационной кардиомиопатией, 20 больных ишемической болезнью сердца, Антитела к детерминанте с молекулярной массой 67 килодальтон, экспрессируемой на поверхности кардиомиоцитов человека, обнаружили только в сыв "ðîòêå крови больных миокардитом с точностью 85%, а по прототипу—

60% (т,е, точность способа увеличивается на

25%).

Способ определения антител к белкам мембраны кардиомиоцитов может использоваться в широкой сети лечебных учреждений, не имеющих специального оборудования, так как результаты определяются визуально, для обследования пациентов с заболеваниями сердца с диагностической целью, а так>ке для выбора адекватной патогенетической терапии и контроля за ее ",ôôåêòèâíîñòüþ. Способ высокоспецифичен, значительно упрощает исследование, поэтому может осуществляться неподготовленным персоналом, исключает проведение биог сии миокарда.

1780007

Составитель В.Литовченко

Редактор С.Кулакова Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Т.Палий

Заказ 4433 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 пользуют мембраны кардиомиоцитов, фиксированных на нитроцеллюлозе с помощью иммуноблоттинга, и при выявлении иммунопреципитата, содержащего белок с мол.м. 67 KD, диагностируют аутоиммунное поражение миокарда,