Способ выделения альфа-фетопротеина из сыворотки крови человека

 

Изобретение относится к биологической химии и может найти применение в медицине для получения высокоочищенного белка альфа-фетопротеина человека. Сущность изобретения заключается в том, что проводят хроматографическое разделение сыворотки крови человека последовательно путем ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-сефарозой, уравновешенной 0,03 - 0,05 M калий-фосфатным буфером с pH 6,1 - 6,3, иммуноафинной хроматографии на колонке с Br-CN, активированной сефарозой CL-4B, связанной с поликлональными антителами кролика против альфа-фетопротеина человека, иммуноафинной хроматографии на колонке с антителами кролика против нормальной сыворотки человека, иммуноафинной хроматографии на колонке с антителами крысы против иммуноглобулинов кролика с последующим нанесением полученного на хроматографическую колонку с биогелем AcA-34, уравновешенную 0,004 - 0,006 M натрий-фосфатным буфером с pH 7,4 - 7, 6, причем в качестве элюирующего раствора при иммуноафинной хроматографии используют 0,03 - 0,05 M калий-фосфатный буфер с pH 6,1 - 6,3, содержащий 0,18 - 0,22 M хлористый натрий, а иммуноафинную хроматографию с поликлональными антителами кролика против альфа-фетопротеина человека проводят буферным раствором 0,04 - 0,05 M Трис-HCl с pH 7,8 -8,0. 1 ил.

Изобретение относится к биологической химии и может найти применение в медицине для получения высокоочищенного белка альфа-фетопротеина человека.

Известен одностадийный процесс выделения фетального альфа-фетопротеина (АФП) человека на фенил сефарозе CL-4B. Выход препарата составлял 91% фактор очистки 976,9 (Karmali A. and Novo C. Biochimie, 1990, 72, 369 374).

Однако этот метод позволяет использовать только малые количества биологического материала. Увеличение объема колонки приводит к значительным потерям и резкому уменьшению чистоты препарата.

Известен многостадийный процесс выделения АПФ, включающий аффинную хроматорграфию на CNBr-сефарозе 4B-моноклональные антитела к АФП человека, хроматографию на Blue-Сефарозе CL-6B и хроматографию на СопА-сефарозе (Chudy and Zizkovsky, Neoplasma, 34, 4, 491 499, 1987).

Несмотря на чистоту препарата более 95% выход белка в указанном способе составил около 20% Наиболее близким к предлагаемому является способ выделения АПФ путем афинной хроматографии исходного сырья сыворотки крови человека на иммобилизованных экстрогенах с последующим отмыванием буферным раствором и элюированием целевого продукта, причем исходное сырье предварительно обрабатывают бутиловым спиртом и подвергают диализу против буферного раствора, а элюирование осуществляется бутиловым спиртом или смесью бутилового спирта с буферным раствором (авт. св. СССР кл. A 61 K 38/42, 1979).

Указанный способ позволяет достигнуть выхода АПФ до 70% с электрофоретической чистотой до 95% Технический результат, достигаемый предлагаемым способом, заключается в повышении степени чистоты препарата АПФ до 10% и увеличении его выхода более 85% Для достижения указанного технического результата в способе выделения АПФ из сыворотки крови человека, предусматривающем хроматографическое разделение исходного сырья, отмывание буферным раствором и элюирование целевого продукта, хроматографическое разделение проводят последовательно путем ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-сефарозой, уравновешенной 0,03 0,05 M калий-фосфатным буфером с pH 6,1 6,3, иммуноафинной хроматографии на колонке с Br-CN, активированной сефарозой CL-4B, связанной с поликлональными антителами кролика против АПФ человека, иммуноафинной хроматографии на колонке с антителами кролика против белков нормальной сыворотки человека, иммуноафинной хроматографии на колонке с антителами крысы против иммуноглобулинов кролика с последующим нанесением белка на хроматографическую колонку с биогелем AcA-34, уравновешенную 0,004 0,006 M натрий фосфатным буфером с pH 7,4 7,6, причем в качестве элюирующего раствора при иммуноафинной хроматографии используют 0,03 0,05 M калий-фосфатный буфер с pH 6,1 6,3, содержащий 0,18 0,22 M хлористый натрий, а иммуноафинную хроматографию с поликлональными антителами кролика против АПФ человека проводят буферным раствором 0,04 0,05 M Трис-HCl с pH 7,8 8,0.

Пример. Сыворотку крови человека, содержащую АПФ в концентрации не менее 50 мкг/мл в количестве 100 мл перед нанесением на колонку разводят в три раза стартовым буфером. Проводят ионообменную хроматографию на колонке с ДЕАЕ-сефарозой, уравновешенной 0,04 M калий-фосфатным буфером, носитель колонки разводили в три раза стартовым буфером в количестве 100 мл. После нанесения сыворотки колонку промывали стартовым буферным раствором, содержащим 0,05 M хлорида натрия. Сорбировавшийся на колонке белок снимали 0,04 M калий-фосфатным буфером, содержащим 0,2 M хлористого натрия.

Фракцию, содержащую альфа-фетопротеин, концентрировали до объема 150 мл, добавляли в нее концентрированный раствор Трис-HCl (pH 8,0) до конечной концентрации 0,05 M и концентрированный раствор хлористого натрия до конечной концентрации 0,5 M. Затем эту фракцию наносили на иммуноаффинную колонку 2,6 x 6,0 см с ковалентно связанными с BrCN-активированной сефарозой CL-4B поликлональными антителами кролика против альфа-фетопротеина человека. Перед нанесением колонку промывали сначала 0,01 M раствором HCl, затем уравновешивали буферным раствором 0,05 M Трис-HCl, pH 8,0. Скорость нанесения составляла 4000 мл в час. После нанесения содержащей альфа-фетопротеин фракции колонку промывали стартовым буфером до тех пор, пока оптическая плотность выходящего с колонки раствора не снижалась до 0,005 оптических единиц. Затем альфа-фетопротеин снимали, пропуская через колонку 0,01 M раствор HCl. Профиль элюции контролировали спектрофотометрически, по поглощению при 280 нм. Практически весь белок сходил с колонки в интервале pH от 6 до 5. Сразу после снятия белка с колонки pH раствора до pH 8,0, добавляя концентрированный Трис-HCl буфер. Объем снятой с аффинной колонки фракции альфа-фетопротеина составлял около 100 мл, концентрация приблизительно 1 мг/мл.

Для того, чтобы очистить выделенный альфа-фетопротеин от возможных следовых количеств белков сыворотки или фрагментов иммуноглобулинов кролика, которые могли быть внесены на стадии афинной хроматографии, полученная фракция наносилась последовательно на аффинную колонку с антителами кролика против белков нормальной сыворотки человека и афинную колонку с антителами крысы против иммуноглобулинов кролика. Полученный после афинной хроматографии белок концентрировали на концентрирующей ячейке с мембраной YM 30 до объема 5 мл и наносили на гельхроматографическую колонку с биогелем AcA-34, уравновешенную 0,005 M натрий фосфатным буфером, pH 7,5. На чертеже показан типичный профиль элюции при хроматографии альфа-фетопротеина на колонке с AcA-34. Фракции 7 - 12 содержат незначительное количество олигомерных форм альфа-фетопротеина. В качестве конечного продукта берут только фракции 13 16. Сразу после стадии гельфильтрации белок был сконцентрирован в концентрирующей ячейке с мембраной YM 30 до конечной концентрации 45 мг/мл и лиофильно высушен. Все операции производились при температуре не выше +8^oC.

Предложенный способ выделения альфа-фетопротеина человека позволяет достигнуть выхода препарата более 85% с электрофоретической чистотой более 98% иммунологическая чистота приближается к 100%

Формула изобретения

Способ выделения альфа-фетопротеина из сыворотки крови человека, предусмативающий хроматографическое разделение исходного сырья, отмывание буферным раствором и элюирование целевого продукта, отличающийся тем, что хрооматографическое разделение проводят последовательно путем ионообменной хроматографии на колонке с ДЕАЕ-сефарозой, уравновешенной 0,03 0,05 М калий-фосфатным буфером с pH 6,1 6,3, иммуноафинной хроматографии на колонке с ВГ CN, активированной сефарозой CL 4В, связанной с поликлональными антителами кролика против альфа-фетопротеина человека, иммуноафинной хроматографии на колонке с антителами кролика против белков нормальной сыворотки человека, иммуноафинной хроматографии на колонке с антителами против иммунноглобулинов кролика с последующим нанесением полученного белка на хроматографическую колонку с биогелем АсА-34, уравновешенную 0,004 0,006 М натрий-фосфатным буфером с pH 7,4 7,6, причем в качестве элюирующего раствора при иммуноафинной хроматографии используют 0,03 0,05 М калий-фосфатный буфер с pH 6,1 6,3, содержащий 0,18 0,22 М хлористый натрий, а иммуноафинную хломатографию с поликлональными антителами кролика против альфафепротеина человека проводят буферным раствором 0,04 0,05 М трис-НСI с pH 7,8 8,0.

РИСУНКИ

Рисунок 1