Способ получения вакцины для профилактики стрептококкоза нутрий

 

Использование: ветеринарная микробиология, биотехнология, вакцина, профилактика стрептококкоза нутрий. Сущность изобретения: для изготовления вакцины против стрептококкоза нутрий штамм Str. Zooepidemicus ВГНКИ N К-ДЕП выращивают в мясопептонном бульоне с 1%-ным раствором глюкозы при температуре 37 - 38^oC в течение 18 - 24 ч. К этому сроку концентрация бактериальной массы должна быть не ниже 4·10⁹ м.к. в 1 мл. Полученную культуральную среду подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкие фракции, инактивируют 0,3 - 0,4%-ным раствором формалина. После инактивации в бактериальную массу вносят стерильный адьювант 3%-ный раствор гидроокиси алюминия. Получаемая формолгидроокисьалюминиевая вакцина обеспечивает формирование стойкого длительного иммунитета. Эпизоотическая эффективность составляет до 98,4% от всех вакцинированных животных. 1 табл.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, а именно к конструированию бактериальных вакцин для профилактики стрептококкоза нутрий.

Стрептококкоз наносит огромный ущерб нутриеводческим хозяйствам: погибает молодняк после отсадки (до 60%), самки абортируют во второй половине беременности (до 80%). При этом большие затраты дополняются нарушением технологии выращивания животных, а также за счет проведения ветеринарно-санитарных мероприятий при ликвидации болезни.

От павших нутрий в хозяйствах с массовым падежом нами был выделен патогенный стрептококк серогруппы C. Были изучены его морфологические, биологические свойства, чувствительность к антибиотикам, что вошло в основу разработанной нами "Временной инструкции о мероприятиях по профилактике и ликвидации стрептококкоза нутрий" (1).

Известный способ профилактики и лечения стрептококкоза нутрий, в основу которого положены санитарно-технологические и лечебные мероприятия, позволяет осуществлять эпизоотологическиий контроль за болезнью на экономически доступном уровне (2). Но вместе с тем неблагополучные хозяйства продолжают нести большие убытки.

В настоящее время не существует специфических средств профилактики стрептококкоза нутрий ни в нашей стране, ни за рубежом. Однако известны способы получения вакцин против стрептококкоза свиней, энтерококковой инфекции телят, ягнят и поросят, которые заключается в основном в получении большого количества токсинов стрептококков при выращивании микробов в течение 6 8 сут. Для изготовления вакцины берут 12 штаммов: 4 выделенных из труппов телят, 4 от ягнят и 4 от поросят. Технология изготовления усложняется многочисленными высевами, требует больших затрат времени, а также сложным контролем на иммуногенность (3). Эти препараты не эффективны в экспериментальных условиях для профилактики стрептококкоза нутрий. Поэтому целью настоящего изобретения является конструирование иммуногенной вакцины против стрептококкоза нутрий, чтобы существующую систему профилактических и оздоровительных мероприятий дополнить вакцинацией поголовья и добиться более эффективного эпизоотологического контроля стрептококкоза нутрий.

Вакцину для профилактики стрептококкоза нутрий готовили на основе штамма стрептококкоза серогруппы C К-ДЕП, который выделен нами от павших нутрий и депонирован в коллекции штаммов микроорганизмов Всероссийского Государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов.

Пример. Для изготовления опытной серии вакцины против стрептококкоза нутрий использовали отдельную ампулу с лиофилизированной культурой стрептококка серологической группы C штамма К-ДЕП. Содержимое ампулы на МПА с 1% глюкозы в 3 4 чашки Петри по следующей методике: 0,1 0,2 мл суспензии культуры штамма вносят на поверхность агара и стеклянным стерильным шпателем распределяют ее по поверхности агара. Этим же шпателем проводят по поверхности агара последовательно еще трех чашек. Посевы на МПА инкубируют 48 ч при 37 37,5^oC. Одновременно делают высевы на МПБ, МППБ под вазелиновым маслом и среду Сабуро по две пробирки с каждой средой и инкубируют при тех же температурных режимах (на среде Сабуро при 20 24^oC) посевы на МППБ и на среде Сабуро 10 сут. а на МПБ 3 сут.

По истечении срока инкубации культуры в каждой питательной среде в отдельности проверяют на чистоту и характер роста визуальным просмотром, а также просмотром мазков, окрашенных по Граму. Рост культур на питательных средах должен быть характерным для возбудителя стрептококкоза.

Из культуры, выросшей на чашках Петри, отбирают 2 3 колонии стрептококков и высевают в МПБ с добавлением 1% глюкозы и инкубируют при температуре 37 37,5^oC 18 22 ч. Проверяют чистоту роста просмотром мазков, окрашенных по Граму, и высевают на МПБ с глюкозой (1%) во флаконы в соотношении 1: 100.

Для приготовления маточной раскладки из флаконов или колб суточную бульонную культуру пересевают в подогретый до температуры 37 37,5^oC МПБ с глюкозой (1%) в 2,5-литровых баллонах из расчета 80 100 мл на 10 л. Посевы культивируют при температуре 37 37,5^oC в течение 18 24 ч.

При удовлетворительных показателях чистоты, pH и оптической концентрации производственную культуру в баллонах замораживают при температуре минус 20^oC в течение 2 сут. Затем культуру оттаивают при комнатной температуре (16 18^oC). При расслоении твердой и жидкой фазы в отношении 1:1 ледяную массу удаляют. К жидкому концентрату разрушенных бактерий вносят 0,3% коммерческого формалина. Инактивацию культур проводят в течение 48 ч при температуре 16 18^oC, подвергая взбалтыванию каждый баллон до 3 4 раз в течение 2 мин.

После инактивации отбирают пробы культур из каждого баллона в отдельности для контроля полноты инактивации и определения концентрации микробных клеток. Для этого проводят посевы в пробирки на МПА, МПБ, МППБ под вазелиновым маслом. Посевы не должны иметь роста в течение 10 дней наблюдения. Концентрацию микробных клеток определяют по оптическому стандарту мутности, и которая должна быть 3 ± 0,1 млрд. микробных клеток в 1 мл, а несвязанного формалина должно быть не более 0,095% По истечении срока инактивации и получения требуемых результатов контроля чистоты (полноты инактивации) и концентрации в бактериальную массу вносят стерильный адъювант 3% -ный раствор гидроокиси алюминия (ГОСТ 1828-81) из расчета 10% к объему культуры. Адъювант вносят при непрерывном помешивании культуры.

Примечание: 3% раствор гидроокиси алюминия на физиологическом растворе стерилизуют в автоклаве при температуре 120^oC в течение 30 мин.

Через 3 сут. после внесения адъюванта формируют серию вакцины, pH готовой вакцины должен быть в пределах 7,0 7,2.

Расфасовку вакцины производят по 20, 100, 200 мл в стерильные флаконы, которые закрывают резиновыми пробками и закатывают алюминиевыми колпачками, обеспечивая герметичность укупорки содержимого флаконов.

Полученная вакцина имеет следующий состав, об.

а) свободный антиген стрептококков, выращенных в течение 18 22 ч, в концентрации (5 6) · 10⁹ микробных клеток/см³ 88,5 б) глюкоза 1,0 в) формалин 0,3 г) гидроокись алюминия до 100 Для определения качества формолгидроокисьалюминиевой вакцины государственный контролер делает выборку из разных мест серии в количестве 10 флаконов, из которых 5 используют для проведения испытаний, а 5 флаконов хранят в архиве государственного контролера в течение 18 месяцев.

Для определения внешнего вида, цвета, наличия посторонней примеси, хлопьев, плесени, неразбивающегося осадка флаконы с вакциной тщательно встряхивают и просматривают визуально в проходящем свете. Одновременно флаконы проверяют на герметичность укупорки и правильность этикетирования.

Концентрацию водородных ионов определяют электрометрическим методом, используя потенциометр марки ЛПУ-01 или другой прибор того же класса точности. Для испытания используют 3 флакона с вакциной. Содержимое каждого флакона испытывают отдельно. Определение pH вакцины проводят по инструкции, приложенной к потенциометру. Вакцина должна иметь pH в пределах 7,0 7,2.

Для проведения испытания на стерильность используют 5 флаконов с вакциной. Посевы проводят из каждого флакона в две пробирки с МПА, МПБ, МППБ и среду Сабуро. Посевы проводят в объеме 0,2 0,3 мл вакцины. Питательные среды с посевами выдерживают в течение 10 дней, роста микрофлоры быть не должно.

Безвредность вакцины проверяют на морских свинках массой 300 350 г и на белых мышах 16 18 г. Три флакона с вакциной встряхивают и из каждого флакона с вакциной с соблюдением стерильности отбирают 20 30 мл препарата, переносят в стерильный флакон, общую пробу используют для определения безвредности и иммуногенности.

Для определения безвредности содержимое флакона тщательно встряхивают и вводят пяти морским свинкам подкожно в области спины в объеме 2 мл и десяти белым мышам подкожно в области спины в объеме 0,5 мл. Вакцина не должна вызывать заболевания и гибели морских свинок и белых мышей в течение 10-дневного срока наблюдения.

Для определения иммуногенной активности общую пробу вакцины во флаконе встряхивают и вводят 20 белым мышам массой 16 18 г подкожно с наружной стороны бедра в дозе 0,2 мл. Через 14 дней после иммунизации 20 вакцинированных и 20 контрольных белых мышей аналогичной массы заражают подкожно в области бедра подтитрованной смертельной дозой вакцинного штамма. Срок наблюдения 10 дней.

Вакцину считают иммуногенной, если она предохраняет от заболевания и гибели не менее 18 иммунизированных мышей в каждой опытной группе, при заболевании всех и гибели не менее 18 белых мышей в контрольных группах в течение 10 дней.

Полученные нами две серии вакцин против стрептококкоза нутрий и известную вакцину против диплококковой септицемии телят, ягнят и поросят мы испытали в производственных условиях (см. таблицу 1). Анализ полученных данных, представленных в таблице 1, достоверно доказывает эффективность вакцины серии N 2 по сравнению с известной вакциной и вакциной серии N 1. Вакцины вводили внутримышечно в области бедра с внутренней стороны в дозах 1,0 и 1,5 с интервалом 7 10 дней. Вакцина серии N 2 безвредна, не вызывает осложнений у вакцинированных нутрий, обладает высокой активностью и профилактирует развитие клинических признаков стрептококкоза и гибель животных от болезни до 98,4% Источники информации 1. Временная инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации стрептококкоза нутрий. Утверждена ГУВ Госагропрома СССР от 21 апреля 1988 г.

2. Стрептококкоз нутрий. Конопаткин А.А. и др. Звероводство и кролиководство, N 1, 1990.

3. Диагностика и профилактика диплококковой септицемии телят, ягнят и поросят. Чепуров В.И. 1956.

Формула изобретения

Способ получения вакцины для профилактики стрептококкоза нутрий, отличающийся тем, что используют штамм Streptococcus zooepidemicus ВГНКИ N К-ДЕП, выращивание его проводят в жидкой питательной среде с добавлением глюкозы до достижения концентрации 4 · 10⁹ 6 · 10⁹ кл/мл, полученную культуральную среду подвергают замораживанию-оттаиванию, отделяют жидкую фракцию, добавляют к ней 0,3 0,4%-ный раствор формалина, выдерживают в течение 44 50 ч и вносят 3%-ный раствор гидроокиси алюминия в количестве 10% к объему культуры.

РИСУНКИ

Рисунок 1