Штамм культивируемых гибридных клеток а6/1-д-продуцент моноклональных антител к полисахариду стрептококка группы а, перекрестно-реагирующих с эпителием

 

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и касается получения гибридных клеток (гибридомы). Цель изобретения - создание гибрйдомы, продуцирующей МКА к одной из детерминант А-полисахарида , перекрестно реагирующих с эпителием кожи тимуса и других органов млекопитающих к человека. В1тамм гибридных клеток (гибридома А6/1-Д) представляет собой гибридную линию клеток-продуцентов МКА. Получение подобной гибридомы достигается иммуш1зацией мышей Balb/c конъюгатом А-полисахарида с полиэлектролитом и получения гибридом по методу кКЫег Milstein путем гибридизации Лимфоцитов селезенки иммунизированных мышей с плазмоцитомой мыши. Получение такой гибридомы создает условия для наработки реагирующих с . эпителием стандартныхлнтител вирепаративных количествах.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИИ И ОТНРЫТИЙ (21) 3843128/28-14 (22) 22.01,85 (46) 30,11.86. Бюл. и 44 (71) Научно-исследовательский ордена Трудового Красного Знамени институт эпидемиологии и микробиологии им. почетного акад. H.Ф.Гамалеи, Научно-исследовательский институт иммунологии и Научно-исследовательский институт трансплантологии и искусственных органов (72) И.M.Ëÿìïåðò, Э.И,Дробышевская, В.Ю.Колесникова, Е.В.Рыжикова, Л.В,Белецкая, H.А,Бородиюк, Р.М.Хантов и А.В.Некрасов (53) 615.373(088 8) (56) Herbst Н., Lsvancy,Brown D..G.

Апп. Immunol. (Inst. Pasteur ), 1983, ч. 134, р. 349-371, (54) ШТАММ КУЛ1 ТИВИРУЕМЫХ ГИБРИДНЬБ

КЛЕТОК Аб/1-Д вЂ” ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К ПОЛИСАХАРИДУ СТРЕПТОКОККА ГРУППЫ А, ПЕРЕКРЕСТНО РЕАГИ-

РУКМЦИХ С ЭПИТЕЛИЕМ (51)4 А 61 К 39/09, G 01 N 33/577 (57) Изобретение относится к медици- не, а именно к иммунологии, и касается получения гибридных клеток (гибридомы). Цель изобретения — создание гибридомы, продуцирующей МКА к одной из детерминант А-полисахарида, перекрестно реагирующих с эпителием кожи тимуса и других органов млекопитающих и человека, П!тамм гибридных клеток (гибридома Аб/1-Д) представляет собой гибридную линию клеток-продуцентов МКА. Получение подобной гибридомы достигается иммунизацией мышей Ва1Ь/с конъюгатом А-полисахарида с полиэлектролитом и получения гибридом по методу

KHhler Milstein путем гибридизации

Лимфоцитов селезенки иммунизированных мышей с плазмоцитомой мьппи. По-. лучение такой гибридомы создает ус" ,ловия для наработки реагирующих с эпителием стандартныхантител впрепаративных количествах.! 273115 з

Изобретение относитс.я к медицине, а именно к иммунологии, и касается получения гибридных клеток (гибридомы), продуцирующих моиоклональные антитела (МКА) к одной иэ детерминант полисахарида стрептококка группы А (А-полисахариду).

Штамм гибрид11ых клеток (гибридома Аб/1-.Д) представляет г. бой гибриднъ ю JIHHHI0 клсггск проду16 ентон МКА реагирующих перекрестно с эктодермальным эпителием нормальных тканей человека и жинотных и опухолевых тканей человека, Целью изобретения является соэдан11е гибридомы, продуцирующей МКА к одной из детерминант А-полисахарида, перекрест1(о реагиру1сшие с эпителием кожи тимуса и других органов

1(1е.сопит(1 0ш11х, По11учение подобной

1ибрило ы с()= ;Iàå г условия Лля наработки рс а1 IIj ó!0I!lè:I с эпителием стлнпартIII„y, ан1итI л в препаративных количествах.

1!олучен11с гибр11домы дости1 антея н рг эультате иммунизации мышей

Ва1Ь/c .. конъюгатом А-полисахарида с полиэлектролитом и получения гибридом по методу Kohler, М21н1;е151 IIyтем гибридизации лимфоцитон селезен-ки иммунизированных мы111ей с плазмоцитомой мыши. В результате отбора моноклонон получена гибридома„ продуцирующая МКА к А-полисахариду, перекрестно реагирующие при испытании не" прямым методом иммунофлюорес ценции с эктодермальным эпителием человека и животных.

Пример l. Мышей Ьа110/с (вес

17-18 г) иммунизируют очищенным Аполисахаридом, выделенным формамидным методом из стрептококков группы

А, обработанных пепсином. 11олисахарид конъюгируют с полиэлектро1н том, В качестве лолиэлектро111та--иммуностимулятора используют молифи .,Нрованный сополимер акрилонс10 кислоты и N винилпирролидона экнимольнс гo состава.. Введение первичных амнпо-. групп в боковую цепь сополимера проводят по реакции ацилиронания карбодиимидным методом. Для получения конъюгатон используют сопо11и11е. ы, содержащие 20 мол.% модифиц lpa 1:.1!IH lx карбоксильных групп. Синтез коп-.юг:.-.та проводят гриазиновым «»OJ!0 ., 2-Аминс-4,б-дихлор-сими-триаэ1..1.,.:;;;гзывается н нейтральной среде (вода

ДМФА) с полисахаридом, а .ас-1м .; шс -5

ЗО

ЗБ

4Î

6" 76 лочной среде (рГ! 9, 5-" 0 ) реагируетт с амино группой сополимер а . Конъюгат выделяют гель-хроматографией, диализуют и лиофилизируют.

Проводят 2 цикла иммунизации.

Первый цикл включает 4 инъекции внутрибрюшинно с интервалом в одну неделю, После 4-недельного перерыва проводят второй цикл иммунизации—

5 инъекций ннутрибрюшинно с интервалом в одну неделю. Вводят конъюгат, оодержаший 1О мкг полисахарида. За 3 дня до гибридизации внутривенно вводят препарат, содержащий 40 мкг полисахарида.

Для получения гибридом используют клеточную линию плазмоцитомы мыши Бр2/О-Ag-14. Клеточная линия дефектна по активности фермента гипоксантингуанин-рибозилтрансфераза, резистентна к 8-азагуанину (20 мкг/мл), не растет на селективной среде ГАТ ( сгипоксантин, аминсптерин, тимидин) и не секретирует иммуноглсбулины.

Клетки растут ь суспензии плотность

5 б роста 5 10 -1 ° 10 клеток на i мл среды. Клетки глазмоцитомы культивируют на среде RPMI-1640 с добавлением 10%-ной эмбриональной сыворотки теленка, 2 мМ глютамина, 10 мМ буфера Хепес., 5 !О 2-меркаптоэтано -5 ла и антибиотиков (пенициллин, стрептомицин).

После гибридизации клетки перено".ÿò на селектинную среду ГАХ, которая состоит из тимидина (1,6 10 ), гипоксантина (1 ° 10 1) и аминоптерина

-7 с4 10 ). Гибридные клоны инкубируют при 37 С н атмосфере 5%-ной С0 в

2 плоскодонных 96-луночных пластиках и в 24-луночных пластинах. На 14-е сутки среду ГАТ, в которой культивироьали гибрицные клоны, меняют на ГГ ( гипоксантин, тимидин) и затем на обы-1н-л0 среду культивирования.

Для слияния клеток н качестве

1сибридизующего агента используют полиэтиленгликоль (ПЗГ) 50%-ной концентрации, м.н. 4000 (ф-ма Серьа,. Родитель-кие клетки применяют

1 в л(7гарифмической фазе роста, Из селез с. .И1си Ва1 г6/с 161ыг61ей > и1г11убнизиронан .;-ых анти1 еном, беруг снленоциты, : рижды промывают з =реде RPYiI-1640 без сыворотки. Для ;лияния исполь=

7 эуют : 10 клеток плаэмоцитомы и.

: -.. 1гЛ лиыфоци гон. ПереФА иянин(I

: -!p) I0ò,, G о /мин, ° v 1.1ин(в с рр1273115 з де без сыворотки. К осадку клеток в течение 60 с добавляют 1 мл ПЭГ, тщательно перемешивают, Далее медленно добавляют среду RPMI-1640 без сыворотки. После слияния клетки центрифугируют при 800 об/мин 5 мин, переносят в селективную среду (TAT) и помещают по 0 1 мл в 96-луночные

Э

6 пластины из расчета 1 10 клеток плазмоцитомы на лунку. На следующие сутки добавляют фидерные клетки в расчете l<)0 -5 *10 клеток на лун1 ку. В качестве фидерных клеток ис-. пользуют макрофаги брюшной полости сингенных или аллогенных мьапей. Через 10-14 сут после скринирования клонов гибридные клетки переводят в большие объемы (О 5-1,0 мл) в 24луночные панели. Клоны, сохраняющие синтез антител, переводят в большие объемы (10-20 мл), эамораживают и клонируют методом лимитирующих разведений в, 96-луночных панелях. Моноклоны„ синтезирующие антитела (1"10 клеток на 1 мл), вводят в брюшную полость мьппей Balb/ñ для получения асцитов.

Морфологические свойства. Гибридные клетки имеют сфернческую форму, ровные края, крупное ядро с узким ободком цитоплазмы, рост в виде гроздьев. Среднее количество хромосом 72.

Скрининг клонов проводят путем определения антител к А-полисахариду в надосадочной жидкости и в асцитах. Антитела определяют иммуноферментным методом с очищенным Аполисахаридом. МКА из среды культивирования гибридом выделяют осаждением при 50Х-ном насыщении сульфа о том аммония.

При определении уровня антител к А-голисахариду иммуноферментным методом в асцитах получены следующие данные. Клон Аб/)-Д вЂ” титр антирс тел к А-полисахариду 1 "50000 Б контрольных опытах проведена ингибиция реакций, полученных при испытании иммуноферментным методом моноклональных антител к А-полисахариду. Установлена полная ингибиция реакции при добавлении очищенного А-полисахарида. Не ингибируют реакции антител с

А-полисахаридом полисахарид А-вариант, имеющий общую антигенную детер- 5 минанту с А-полисахаридом, и пептидогликан,, выделенный иэ клеточной стенки стрептококка группы А.

Пример 2, Использованы МКА к А-полисахариду, продуцируемые моноклоном Аб/)-Д, перекрестно реагирующие с эпителием человека. NKA получены иэ надосадочной жидкости в результате культивирован я клона в среде при дозе посева клеток 1»

i)0 -5 10 на 1 мл и заборе среды на 3-4-е сутки или при получении асцитов мышей на )4-17-е сутки после введения клеток в дозе 5 ° 10

) 107

Определение реакции MKA с эпителиальными клетками. Надосадочная жидкость и асциты испытывают непрямым методом иммунофлюоресценции с мечеными флюоресцеином антителами к IpG мыши. Испытания проводят на срезах тканей тимуса и. кожи человека

t морской свинки и мышей, а также на опухолях человека эпидермального генеза. В контрольных опытах проводят испытания на тканях сердца, печени, селезенки и других органах. Положительные реакции получены с зпителиальными клетками тимуса и кожи и не обнаружены на других тканях, не содержащих эктодермального эпителия. Положительные реакции показаны также на эпителиальных опухолях человека. В контрольных опытах установлено, что очищенный А-полисахарид ингибирует реакции с эпителиальными клетками.

Реакции с эпителием на срезах кожи обнаруживаются только с базальным слоем, в котором присутствуют наименее дифференцированные эпителиальные клетки эктодермального происхождения.

Положительные реакции получают на эпителиальных опухолях человека

1базально-клеточный рак), отрицательные реакции — в контроле на сре. зах гепатомы мышей.

Специфичность реакций с эпителием подтверждена в результате постановки огытов ингибиции. Показано, что добавление 2 мг А-полисахарида к 0,2 мл надосадочной жидкости ингибирует эту реакцию, Полисахарид стрептококка А-вариант, а также пептидогликан в той же концентрации стрептококка группы А не ингибируют этих реакций. Продуцируемые МКА относятся к IgG.

Полученные МКА могут быть использованы в экспериментальных исследованиях для выяснения механизмов, Составитель Л,Падюков

Техред П.Сердюкова Корректор Е.Рошко

Редактор И.Рыбченко !. Hp83R 600 Подписное

ВНИИПИ Государство;..::::..: u комитета СССР по делам изобрете .ы н открытий

113035, Москва, М-35, »ти кая наб,, д, 4/5

Заказ 6365/6

Производственно-полиграфическое †;:=-„: ;риятие„, г. Ужгороп,ул. Проектная, 3 12731 приводящих к развитию аутоимммуного процесса, и разработке на этой ос" нове методов лечений и профилактики аутоиммунного процесса, возникающего при инфицировании стрептококком группы А, а также могут быть использованы для диагностикк опухолей эпидермального происхождения иммунофлюоресцентным методом, 15 Ь

Формула изобретения

Штамм культивируемых гибридных клеток Аб/1-Д (хранится в коллекции

НИИ вирусологии AMH СССР под Ф 4-28) — продуцент моноклональных антител к полисахариду стрептококка группы А, перекрестно реагирующих с эпителием,