Штамм streptomyces cremeus 1979 - продуцент апрамицина

 

Использование: в биотехнологической промышленности, в производстве антибиотиков. Штамм Streptomyces cremeus 1979 ГНЦА 2166-продуцент антибиотика апрамицина получен путем воздействия мутагенами на музейную культуру Streptomyces cremeus subsp tobpamycini с последующим поэтапным отбором вариантов, наиболее продуктивных по апрамиину и характеризующихся отсутствием сопутствующих антибиотиков.

Изобретение относится к биотехнологической промышленности, а именно к производству антибиотиков и может быть использовано при производстве антибиотика апрамицина, применяемого в ветеринарии для профилактики и лечения инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных и птицы.

Апрамицин является аминогликозидным антибиотиком, одним из компонентов небрамицинового комплекса, синтезируемого рядом стрептомицетов.

Известны культуры Str. tenebrarlus АТСС 17920, АТСС 17921 и NRRL 3816 - продуценты небрамицинового комплекса, содержащего до 6 компонентов, включая и апрамицин, с суммарной антибиотической активностью комплекса 680 мкг/мл [1-3].

Общим недостатком этих штаммов является невысокая продуктивность и одновременное с апрамицином образование в культуральной жидкости других аминогликозидных антибиотиков, что затрудняет и усложняет последующие процессы выделения апрамицина.

Известен отечественный штамм Streptomyces cremeus var. nebramycini 2242-ЛБ, синтезирующий комплекс из двух антибиотиков - карбамоилтобрамицина и апрамицина. При этом содержание апрамицина в этом комплексе составляет 45 - 50% [4]. Этот штамм рассматривается в качестве прототипа, как содержащий наименьшее по сравнению с другими известными штаммами количество сопутствующих антибиотиков.

Однако присутствие в культуральной жидкости этого штамма второго антибиотика затрудняет выделение апрамицина, как индивидуального соединения.

Сущность изобретения заключается в получении штамма Streptomyces cremeus, отличающегося от штамма-прототипа неспособностью к синтезу других антибиотиков небрамицинового комплекса.

Предлагаемый штамм Streptomyces cremeus 1979 получен путем воздействия мутагенами на музейную культуру Streptomyces cremeus subsp. tobramycini с последующим поэтапным отбором вариантов, наиболее продуктивных по апрамицину и характеризующихся отсутствием сопутствующих антибиотиков.

Продуктивность культуры оценивалась по накоплению апрамицина в культуральной жидкости микробиологическим методом диффузии антибиотика в агар с использованием в качестве тест-объекта культуры Bac.subtilis АТСС 6633. Наличие сопутствующих антибиотиков в культуральной жидкости определялось методом тонкослойной хроматографии.

Штамм Streptomyces cremeus 1979 характеризуется продуктивностью по апрамицину до 6000 мкг/мл и отсутствием синтеза сопутствующих антибиотиков небрамицинового ряда.

Штамм Streptomyces cremeus 1979 хранится в Коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра по антибиотикам под регистрационным номером 2166 и характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические характеристики Минеральный агар Гаузе N1. Рост хороший, воздушный мицелий мучнистый, мраморно-розовый, субстратный мицелий бесцветный. Растворимые пигменты отсутствуют.

Глицерин-нитратный агар Линденбайна. Рост обильный, воздушный мицелий мраморно-розовый, субстратный мицелий желтоватый. Растворимые пигменты отсутствуют.

Овсяный агар. Рост мицелия крайне слабый. Воздушный мицелий бледно-оранжево-желтый, субстратный мицелий бесцветный. Растворимые пигменты отсутствуют.

Органический агар Гаузе N2. Рост обильный, воздушный мицелий бархатистый, от белого до бледно-розовато-палевого, субстратный мицелий бледно-коричневатый. Растворимые пигменты отсутствуют.

Крахмало-аммиачный агар. Нет роста.

На пептоно-дрожжевом агаре, содержащем цитрат железа, меланоидные пигменты не образует.

Цепочки спор спиральные с 2 - 6 оборотами, споры гладкие.

Физиолого-биохимическая характеристика Культура утилизирует глюкозу, фруктозу, рамнозу, инозит, сахарозу, глицерин. Не использует арабинозу, лактозу, ксилозу, маннит, сорбит, целлюлозу. Крахмал гидролизует.

В качестве азотного питания использует цептон, нитраты, аммиак, азот аминокислот. Обладает протеолитической активностью. Желатину разжижает, молоко пептонизирует.

Растет в диапазоне температур 20 - 40^oC. Для роста требует кислород воздуха. Продуцирует аминогликозидный антибиотик апрамицин.

Анатагонистические свойства Подавляет рост грамположительных и грамотрицательных бактерий и дрожжеподобных грибов.

Маркерная характеристика Наличие в гидролизатах клеток 4-суточной культуры, выращенной глубинно в жидкой среде Линденбайна, двух изомеров 2,6-диаминопимелиновой кислоты (LL- и мезо-ДАПК) в соотношении 1:3.

Биотехнологическая характеристика В качестве целевого продукта штамм продуцирует апрамицин. При культивировании в питательной среде состава (%) : глюкоза - 2,3; крахмал - 1,5; соевая мука - 1,5; аммоний сернокислый - 0,3; кальций углекислый - 0,3, в условиях непрерывного перемешивания и аэрации, соответствующей сульфитному показателю 0,8 ммоль O₂/л.мин. накопление апрамицина через 96 ч ферментации составляет 4800 мкг/мл.

При культивировании на питательной среде состава (%); крахмал - 3,5; соевая мука - 1,5; аммоний сернокислый - 0,3; кальций углекислый - 0,3, в условиях непрерывного перемешивания и аэрации, соответствующей сульфитному показателю 0,8 ммоль O₂/л.мин. накопление апрамицина через 96 часов ферментации составляет 6000 мкг/мл.

Хранение штамма Хранить штамм рекомендуется в виде лиофильно высушенной культуры в стеклянных запаянных ампулах или в пробирках на скошенном агаре Линденбайна с периодическими пересевами.

Промышленная применимость штамма Str.cremeus 1979 при биосинтезе антибиотика апрамицина иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Культуру штамма 1979 хранят в лиофилизированном состоянии в запаянных ампулах при температуре 2-4^oC. Защитной средой для лиофилизации служит сыворотка бычьей крови. С целью оживления культуры в ампулу заливают 1 мл стерильной воды, производят посев полученной суспензии на скошенный в пробирках агар Линденбайна и термостатируют их в течение 7-10 сут при температуре (37+1)^oC.

Для приготовления вегетативного посевного материала спорами культуры, выращенной на агаре Линденбайна, засевают колбы с питательной средой следующего состава (%): глюкоза - 0,3; соевая мука- 2,0; натрий хлористый - 0,3; кальций углекислый - 0,3; pH до стерилизации 6,7-7,0. Культуру в колбах выращивают на качалке с 220-240 об/мин при температуре (37+1)^oC в течение 24 ч.

Полученный вегетативный посевной материал в количестве 5,0 об.% используют для засева ферментационной питательной среды следующего состава (%): глюкоза - 2,3; крахмал - 1,5; соевая мука - 1,5; аммоний сернокислый - 0,3; кальций углекислый - 0,3; pH до стерилизации 6,7-7,2.

Культивирование осуществляют при температуре (37+1)^oC, постоянном перемешивании и аэрации среды, достаточной для достижения сульфитного показателя на уровне 0,8 ммоль O₂/ л·мин, в течение 96 ч.

Содержание апрамицина в культуральной жидкости, определенное микробиологическим методом диффузии антибиотика в агар, составляет 4800 кг/мл.

Результаты тонкослойной хроматографии фильтрата культуральной жидкости в системе хлороформ, этиловый спирт, аммиак водный концентрированный в соотношении 1: 3: 2 после проявления хроматограммы смесью растворов бензидина в уксусной кислоте и иодистого калия показывают отсутствие каких-либо других аминогликозидов кроме апрамицина.

Пример 2. Хранение культуры штамма 1979, а также получение спорового посевного материала на агаризованной среде аналогичны изложенным в примере 1.

Для приготовления вегетативного посевного материала спорами культуры, выращенной на агаре Линденбайна, засевают колбы с посевной питательной средой следующего состава (%): крахмал - 3,5; соевая мука - 1,5; натрий хлористый - 0,3; кальций углекислый - 0,3; pH до стерилизации 6,5 - 6,7. Культуру в колбах выращивают на качалке с 220 - 240 об/мин при температуре (37+1)^oC в течение 24 ч.

Поученный вегетативный посевной материал в количестве 5,0 об.% используют для засева ферментационной питательной среды следующего состава (%): крахмал - 3,5; соевая мука - 1,5; аммоний сернокислый - 0,3; кальций углекислый - 0,3; pH до стерилизации 6,5 - 6,7.

Культивирование осуществляют при температуре (37+1)^oC, постоянном перемешивании и аэрации среды, достаточной для достижения сульфитного показателя на уровне 0,8 ммоль O₂/л·мин в течение 96 ч.

Содержание апрамицина в культуральной жидкости, определенное микробиологическим методом диффузии антибиотика в агар, составляет 6000 мкг/мл.

Результаты тонкослойной хроматографии фильтрата культуральной жидкости в системе хлороформ, этиловый спирт, аммиак водный концентрированный в соотношении 1: 3: 2 после проявления хроматограмм смесью растворов бензидина в уксусной кислоте и иодистого калия показывают отсутствие каких-либо других амино-гликозидов кроме апрамицина.

Приведенные данные подтверждают преимущество штамма 1979 пред штаммов - прототипом 2242-ЛБ, заключающееся в отсутствии сопутствующих апрамицину аминогликозидов в культуральной жидкости, отвечая критерию изобретательский уровень предложения, а также подтверждают, что предложение промышленно осуществимо.

В общедоступной патентной и научно-технической литературе не известны технические решения поставленной задачи аналогичные заявляемому, т.е. предложение соответствует критерию новизна.

Источники информации 1. Патент Великобритании, B 178489, 1967, C 12 D 9/14.

2. Патент США, 3691279, 1972, A 61 K 21/00.

3. Патент США, 3853709, 1972, C 12 D 9/00, 4. Жиганова Л.П., Лапчинская О.А., Синягина О.П., В.И.Орловский. Мутагенез y Streptomyces cremeus subsp. nebramycini для повышения продукции апрамицина при биосинтезе многокомпонентного антибиотического комплекса. Биотехнология N 4. 1986. с. 7 - 11 - прототип.

Формула изобретения

Штамм Streptomyces cremeus 1979 ГНЦА 2166 - продуцент апрамицина.