Фармацевтическая композиция

 

Композиция предназначена для использования в качестве модулятора пролиферации и/или дифференциации клеток HL-60, в частности для системного лечения острой промиелоцитарной лейкемии. При этом могут быть использованы низкие дозы и решена проблема толерантности или нежелательных побочных эффектов. Композиция содержит по крайней мере один лиганд, обладающий селективной активностью к рецепторам RXR_s, и по крайней мере один второй лиганд, обладающий селективной активностью к рецепторам RAR-α, в фармацевтически приемлемом носителе. 6 з.п. ф-лы, 4 ил.

Изобретение относится к новым композиция, в частности фармацевтическим, содержащим синергетические смеси, по крайней мере одного лиганда, обладающего селективной активностью к ядерным рецепторам типа RXR_s, и с другой стороны, по крайней мере одного лиганда, обладающего селективной активностью к ядерным рецепторам типа RAR-d, а также к применению указанных композиций в качестве модулятора пролиферации и/или дифференциации конкретного типа клеток (клетки HL-60), в частности для системного лечения острой промиелоцитарной лейкемии.

Известно, что ретиноидная кислота является мощным модулятором (т.е. ингибитором или, наоборот, стимулятором, в зависимости от природы обрабатываемых клеток) дифференциации или пролиферации многих типов нормальных или трансформированных клеток. Например, она ингибирует дифференциацию эпителиальных клеток, таких как кератиноциты эпидермиса. Она также ингибирует пролиферацию многочисленных трансформированных клеток, таких как клетки меланом. Эти воздействия на пролиферацию и дифференциацию могут одновременно влиять на один и тот же тип клетки, как это происходит, например, в случае человеческих промиелоцитарных клеток, называемых HL-60, так, известно, что пролиферация этих клеток ингибируется ретиноидной кислотой и в то же время что их дифференциация в гранулоциты возрастает.

Клетки HL-60, указанные выше, являются особенно интересными и важными с учетом того принципиального факта, что они являются аналогами промиелоцитарных клеток пациентов, которые страдают острой пропиелоцитарной лейкемией. Этих пациентов действительно лечат ретиноидной кислотой, такое лечение по крайней мере в первое время вызывает заметную ремиссию болезни. Однако у пролеченных таким образом пациентов наблюдают явление резистенции или устойчивости в отношении к ретиноидной кислоте, которое препятствует эффективности лечения в срок.

В общем известно, что полностью трансретиноидная кислота воздействует на дифференциацию и пролиферацию интересующих клеток через ядерные рецепторы или RAR_s (Рецепторы ретиноидной кислоты), находящиеся в ядре клетки. На сегодняшний день существует три идентифицированных подтипа рецепторов RAR, называемых соответственно RAR-α, RAR-β и RAR-γ. Эти рецепторы после фиксации лиганда (т.е. ретиноидной кислоты) вступают во взаимодействие с промоторной областью генов, регулируемой ретиноидной кислотой на уровне элементов специфических ответов. Чтобы зафиксироваться на элементах ответа RAR_s гетеродимеризуются с другим типом рецепторов, известных под названием RXR_s. Природным лигандом RXR_s является 9-цис-ретиноидная кислота. Как и для полностью трансретиноидной кислоты известно, что 9-цис-ретиноидная кислота способна, с одной стороны, ингибировать пролиферацию вышеупомянутых HL-60 клеток, а, с другой стороны, стимулировать их дифференциацию в гранулоциты. RXR_s рассматриваются как "мастер-регуляторные протеины", потому что они взаимодействуют с другими мембранами суперсемейства стероидных рецепторов, таких как рецептор витамина ДЗ (VDR) или рецептор трииодтироксина (TR). Кроме того, RXR_s могут взаимодействовать с элементами специфического ответа в форме гомодимеров.

Многочисленные структурные синтетические аналоги ретиноидной кислоты или 9-цис-ретиноидной кислоты, обычно называемые "ретиноидами", были описаны к настоящему времени в литературе. Некоторые из этих молекул способны фиксироваться и специфически активировать RAR_s или, напротив, RXR_s. К тому же некоторые аналоги могут фиксироваться и активировать подтип конкретного рецептора RAR (α, β или γ). Наконец, другие аналоги не обладают никакой конкретной селективной активностью по отношению к этим различным рецептором. В этом отношении и, например, 9-цис-ретиноидная кислота активна одновременно по отношению к RAR_s и RXR_s без заметной селективности к тому или другому из этих рецепторов (неспецифический лиганд), тогда как полностью трансретиноидная кислота, сама по себе, селективна к RAR_s (специфический лиганд RAR_s) любых смешанных подтипов. Обычно и качественно данное вещество (или лиганд) считается селективным по отношению к семейству данных рецепторов (соответственно по отношению к конкретному рецептору этого семейства), когда указанное вещество обладает высоким сродством к совокупности рецепторов этого семейства (соответственно к конкретному рецептору из этого семейства) и, кроме того, оно обладает низким сродством к любым рецепторам любого другого семейства (соответственно к любым другим рецепторам того же семейства или другого). Количественно сродство измеряется с помощью классических методик связывания (величины Kd) и обычно допускают, что любое вещество, которое в отношении первого данного рецептора имеет Kd по крайней мере в 10 раз ниже, а предпочтительно по крайней мере в 15 раз ниже, чем Kd, которое оно имеет по отношению ко второму данному рецептору, может быть квалифицировано как вещество, селективное по отношению к этому первому рецептору в сравнении с этим вторым рецептором. Оценка наличия селективного характера у данного вещества по отношению к данному рецептору обычно проводится с помощью биологических тестов in vitro, известных вообще, как это будет приведено далее.

Заявитель теперь обнаружил, что смесь, новая сама по себе и применяемая, например, в качестве лекарства, (i) ретиноида, специфического к подтипу конкретного рецептора, а именно к рецептору RAR-α, и (ii) ретиноида, специфического к RXR_s, позволяет прекрасно модулировать пролиферацию, с одной стороны (которая здесь ингибируется), и дифференциацию, с другой стороны (которая здесь повышается), описанных ранее клеток HL-60. Этот результат является тем более неожиданным и удивительным, потому что вещество, специфическое к RXR_s, когда оно используется индивидуально, не обладает никакой или практически никакой четкой активностью по отношению к этим самым клеткам и что ретиноид, специфический к RAR_s (любому совпадающему подтипу) также является неактивным, когда его используют индивидуально. Кроме того, смесь ретиноида, специфического к RAR-β или RAR-γ, c ретиноидом, специфическим к RXR_s, не проявляет сама по себе никакой активности.

Это открытие послужило основой настоящего изобретения.

Смесь согласно изобретению, а именно ретиноида, специфического к RAR-α, и ретиноида, специфического к RXR_s, вследствие высокой активности, которой она обладает по отношению к HL-60 клеткам, естественно находит преимущественное применение для лечения системным путем пациентов, страдающих острой промиелоцитарной лейкемией.

Так, в одном из своих преимущественных аспектов объектом настоящего изобретения являются новые композиции, например лекарственные, которые отличаются тем, что они содержат в физиологически приемлемом носителе по крайней мере один лиганд, обладающий селективной активностью по отношению к рецепторам RXR_s, и по крайней мере один второй лиганд, обладающий селективной активностью по отношению к рецептору RAR-α. Объектом изобретения также является применение указанной выше композиции в качестве или для производства фармацевтических композиций и/или дерматологических композиций (лекарств), более конкретно предназначенных для модулирования пролиферации и/или дифференциации клеточной системы типа HL-60, например, для системного лечения острой промиелоцитарной лейкемии.

В общем следует отметить, что активные дозы, в которых применяются смеси для получения стойкого желаемого эффекта, согласно изобретению всегда являются очень низкими, что составляет важное преимущество, когда речь идет о столкновении с проблемами толерантности или нежелательных побочных эффектах, которые могут возникнуть в организмах, подвергаемых лечению, или во время лечения.

Другие существенные признаки, аспекты, объекты и преимущества изобретения будут более четко видны при чтении описания и рисунков, которые прилагаются, а также из различных конкретных примеров, которые приведены только для иллюстрации и не имеют ограничивающего характера.

Описание рисунков (природа соединений 1 и 4 ниже приведена в последующем описании): Фиг. 1: Влияние смеси соединения 1, специфического к RAR-α, и соединения 4, специфического к RXR_s, на пролиферацию HL-60 клеток.

Фиг. 2: Влияние смеси соединения 1, специфического к RAR-α, и соединения 4, специфического к RXR_s, на дифференциацию HL-60 клеток.

Фиг. 3: Влияние смеси соединения 3 (а именно 6-[3-(1-адамантил)-4-оксифенил] -2-нафтойной кислоты, использованной здесь ниже в примерах), специфического к RAR-γ, и соединения 4, специфического к RXR_s, на пролиферацию HL-60 клеток.

Фиг. 4: Влияние смеси соединения 3, специфического к RAR-γ, и соединения 4, специфического к RXR_s, на дифференциацию HL-60 клеток.

В последующем описании под "местным путем" понимают любую технику введения продукта прямым нанесением этого последнего на поверхностную (или внешнюю) часть тела, такую как кожа, а под "системным путем" понимают любую технику введения продукта другим путем, чем местный, например, орально или парентерально.

Следовательно, объектом изобретения являются лекарственные композиции, предназначенные, например, для лечения вышеупомянутого расстройства, и которые отличаются тем, что они содержат в физиологически приемлемом и совместимым со способом введения носителе, удерживающим эти последние, по крайней мере один первый лиганд, обладающий селективной активностью к рецепторам RXR_s, и по крайней мере один второй лиганд, обладающий селективностью к рецептору RAR-α, в качестве активного начала. Разумеется возможно применять один или несколько лигандов, обладающих специфической активностью по отношению к рецепторам RXR_s, в смеси с одним или несколькими лигандами, обладающими специфической активностью по отношению к рецептору RAR-α. Введение композиций согласно изобретению может быть проведено энтеральным, парентеральным, местным путем или через глаза. Однако предпочтительно эти последние композиции объединяют в форму, удобную для применения системным путем.

Для энтерального пути лекарственные препараты могут находиться в виде таблеток, капсул, драже, сиропов, суспензий, растворов, порошков, гранул, эмульсий, микросфер или наносфер, или липидных или полимерных пузырьков, позволяющих контролируемое высвобождение. Для парентерального введения композиции могут находиться в виде растворов или суспензий для перфузии или для инъекции.

Активные смеси согласно изобретению обычно вводят ежедневными дозами от примерно 0,01 до 10 мг/кг массы тела 1-3 раза в день.

Для местного применения фармацевтические композиции, которые более конкретно предназначены для лечения кожи или слизистых, могут находиться в виде мазей, кремов, молочка, помады, пудры, пропитанных тампонов, растворов, гелей, спреев, лосьонов или суспензий. Они также могут находиться в виде микросфер или наносфер, или липидных или полимерных пузырьков, или полимерных пластырей и гидрогелей, позволяющих контролируемое высвобождение активного начала. Эти композиции для местного применения, кроме того, находятся или в безводной форме или в водной форме в зависимости от клинических показаний.

Композиции для местного применения согласно изобретению содержат один или несколько ретиноидов, специфических к RXR_s, в концентрации, обычно лежащей между 0,001 и 10 мас.%, предпочтительно между 0,1 и 1 мас.%, по отношению к общей массе композиции и один или несколько ретиноидов, специфических к RAR-α, в концентрации, обычно лежащей между 0,001 и 10 мас.%, предпочтительно между 0,1 и 1 мас.%, по отношению к общей массе композиции.

При введении через глаза они являются глазными каплями.

Лекарственные композиции согласно изобретению, разумеется, кроме того, могут содержать вспомогательные вещества, инертные или фармакодинамически активные, или сочетания этих вспомогательных веществ, например смачивающие агенты, депигментирующие агенты, такие как гидрохинон, азелаиновая кислота, кофейная кислота или койевая кислота, смягчающие агенты, гидратирующие агенты, например глицерин, ПЭГ 400, тиаморфолинон, и их производные или же еще мочевину, антисеборрейные агенты или противоакневые агенты, такие как S-карбоксиметилцистеин, S-бензилцистеамин, их соли или их производные, или пероксид бензола, противогрибковые агенты, такие как кетоконазол или полиметилен-4,5-изотиазолидоны-3, антибактериальные агенты каротиноиды, и, например, β- каротин, противопсориазные агенты, такие как антралин и его производные, и, наконец, эйкоза-5,8,11,14-тетраиновая и эйкоза-5,9,11-трииновая кислоты, их сложные эфиры и амиды.

Композиции согласно изобретению также могут содержать агенты для улучшения вкуса, консерванты, такие как сложные эфиры параоксибензойной кислоты, стабилизаторы, регуляторы влажности, регуляторы pH, модификаторы осмотического давления, эмульгаторы, УФ-А и УФ-В фильтры, антиоксиданты, такие как α-токоферол, бутилоксианизол или бутилокситолуол.

Как указывалось ранее, селективный или неселективный характер данного вещества по отношению к одному или нескольким данным ядерным рецепторам может быть определен с помощью тестов, классических для специалиста в данной области. Эти тесты, например, описаны в следующих ссылках: (I) "Selective Synthetic Ligands for Nuclear Retinoic Acid Receptor Subtupes" b RETINOIDS, Progress in Research and Clinical Applicatiоns, Chapitre 19 (pp 261 - 267), Marcel Dekker Inc. под редакцией Maria A. Livrea et Lester Packer; (2) "Synthetic Retinoids: Receptor Selectivity and Biological Activity" в Pharmacol Skin, Basel, Karger, 1993, т. 5: стр. 117 - 127, (3) "Selective Synthetic Ligands for Human Nuclear Retinoic Acid Receptors" в Scin Pharmarology, 1992, т. 5, стр. 57 - 65, (4) "Identification of Synthetic Retinoyds With Selectivity for Human Nuclear Retinoic Acid Receptor -γ" в Biochemical and Biophysical Research Communications, т. 186, N 2, июль 1992, стр. 977 - 983, (5) "Selective High Affinity RAR -α or RAR -β Retinoic Acid Receptor Ligands" b Mol. Pharmacol., т. 40, стр. 556 - 562.

В качестве примеров ретиноидов, селективных к RAR-α, используемых в рамках настоящего изобретения, можно привести, например: - 4-[(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафтил)-карбоксамидо]-бензойную кислоту (соединение I, использованное ниже в примерах).

- 4-[(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафтил)-карбамоил] бензойную кислоту (соединение 2).

В качестве примеров, ретиноидов, селективных к RXR_s, подходящих для изобретения, более конкретно здесь можно привести: - 4-[(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тераметил-2-нафтил)- карбонилэтиленацеталь]-бензойную кислоту (соединение 4, использованное ниже в примерах).

- (E)-2-[2-(3,5,5,8,8-пентаметил-5,6,7,8-тетрагидро-2-нафтил)-1-пропенил]-4-тиофенкарбоновую кислоту (соединение 5).

- 4-[(3,5,5,8,8-пентаметил-5,6,7,8-тетрагидро-2-нафтил)карбонил] -бензойную кислоту (соединение 6).

Как указывалось ранее, композиции согласно изобретению могут быть выгодно использованы с целью модулирования in vitro и/или in vivo пролиферации и/или дифференциации клеточных систем типа HL-60. Эти клетки описаны, например, в следующих публикациях: (I) "Induction of Differentiation of Human Promyelocytic Leukemia Cell Line (HL-60) by Retinoic Acid" в Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, pp. 2936-2940, и (2) "Human Leukemic Models of Myelomonocytic Development: a review of the HL-60 and N 937 cell lines" в J. Lencocyte Biology, 37, pp 407-422 и, кроме того, они являются доступными в форме культур из Европейской Коллекции Культур Клеток Животных, Биологическое Подразделение, Порто Даун, Зальцбург SP4 OJY, Англия.

Еще более конкретно композиции согласно изобретению находят преимущественное терапевтическое применение при лечении in vivo и/или in vitro острой промиелоцитарной лейкемии.

Ниже приводятся в качестве неорганических несколько примеров, предназначенных, с одной стороны, для иллюстрации эффекта, достигаемого по настоящему изобретению, а с другой стороны, для иллюстрации различных конкретных рецептур согласно изобретению.

Пример 1.

Целью этого примера является доказательство активности in vitro синергетических ассоциаций согласно изобретению на пролиферацию и/или дифференциацию клеток HL-60.

Использованные HL-60 клетки являются клетками, которые были получены непосредственно из Европейской Коллекции Культур Клеток Животных, указанной выше.

Отчет об испытаниях активностей (пролиферация, дифференциация) Культура клеток: Клетки культивируют при 37^oC во влажной атмосфере в присутствии 5% CO₂ в среде RPMI 1640 (Гибко), дополненной глутамином (40 мМ) и 10% (объем/объем) фетальной сыворотки теленка (SVF).

Обработка клеток: Клетки HL-60 высевают из расчета 4·10⁵ клеток в 2 мл среды в среду RPM1 1640 (Гибко), дополненную Hepes-буфером pH 7,3 (10 мМ), глутамином (40 мМ), трансферрином (5 мг/мл), инсулином (5 мг/мл), селеном (5 нг/мл) и 2% (объем/объем) SVF в плашки с ячейками (puits de cluster) 10 см². Клетки обрабатывают после высева ретиноидами (соединения 1,3 или 4, как определены ранее в описании), разбавленными в ДМСО. Конечная концентрация ДМСО в культуральной среде не превышает 0,2% (объем/объем). После 4 дней культивирования клетки собирают для определения пролиферации и дифференциации.

Измерение пролиферации: Пролиферацию клеток определяют с помощью прибора, называемого "Cell proliferation Kit II" (определение XTT), применяемого в соответствии с указаниями изготовителя (Boehringer, ref, 1465 05). Она выражена в единицах поглощения при 495 нм. Чем ниже измеренное поглощение, тем больше ингибируется пролиферация клеток HL-60.

Измерение дифференциации:
Дифференциацию клеток HL-60 в гранулоциты или моноциты измеряют с помощью NBT-теста (нитро голубой тетразолий) (T.R. Breitman, Growth and differentiation of human myeloid leukemia cell line HL-60" в Methods in Enzymology, т. 190, pp. 118 - 130 (ред. L. Packer/Academic Press Inc. New York (1990)). Этот тест позволяет определить количество дифференциированных клеток по отношению к общему количеству клеток.

Все полученные результаты объединены на фиг. 1 - 4. Эти рисунки количественно оценивают эволюцию степени ингибирования пролиферации клеток HL-60 или эволюцию количества дифференциированных клеток HL-60 в зависимости от использованных активных продуктов, с одной стороны, и их концентрации, с другой стороны. Величины, приведенные в точке контроля, соответствуют найденным результатам, когда не применяют никаких ретиноидов, специфических к RXR_s, наоборот кривая ДМСО /-о-/ соответствует результатам, полученным, когда применяют в качестве активного начала только ретиноид, специфический к RXR_s.

Эти рисунки четко показывают, что смесь ретиноида, специфического к RAR-α (соединение 1), и ретиноида, специфического к RXR_s (соединение 4), обладает очень высокой активностью к пролиферации и дифференциации клеток HL-60 (см. фиг. 1 и 2), тогда как смесь ретиноида, специфического к RAR-γ (соединение 3) с тем же самым ретиноидом, специфическим к RXR_s, не показывает активности (см. фиг. 3 и 4).

Пример 2.

В этом примере приведены различные конкретные рецептуры на основе смесей согласно изобретению (соединения 1 и 4 определены ранее в описании).

A - ОРАЛЬНЫЙ ПУТЬ
а) Таблетка 0,2 г
соединение 1 - 0,001 г
соединение 4 - 0,001 г
крахмал - 0,113 г
дикальций фосфат - 0,020 г
оксид кремния - 0,020 г
лактоза - 0,030 г
тальк - 0,010 г
стеарат магния - 0,005 г
(б) суспензия для питья в ампулах 10 мл
соединение 1 - 0,05 г
соединение 4 - 0,05 г
глицерин - 1,000 г
сорбит 70%-й - 1,000 г
сахаринат натрия - 0,010 г
метиловый эфир параоксибензойной кислоты - 0,080 г
отдушка - по потребности
очищенная вода - до 10 мл
B - МЕСТНЫЙ ПУТЬ
(а) мазь
соединение 1 - 0,1 г
соединение 4 - 0,1 г
изопропилмиристат - 81,520 г
жидкое вазелиновое масло - 9,100 г
оксид кремния ("Аэросил 200" фирма ДЕГУССА) - 9,180 г
(б) Неионный крем вода-в-масле
соединение 1 - 0,100 г
соединение 4 - 0,100 г
смесь эмульгированных ланолиновых спиртов, восков и масел ("Безводный эуцерин", продаваемый фирмой BDF) - 39,900 г
метиловый эфир параоксибензойной кислоты - 0,075 г
пропиловый эфир параоксибензойной кислоты - 0,075 г
стерильнная деминерализованная вода - до 100 г
(в) Лосьон
соединение 1 - 0,100 г
соединение 4 - 0,100 г
полиэтиленгликоль (ПЭГ 400) - 69,800 г
этанол 95%-й - 30,000 г
(г) гидрофобная мазь
соединение 1 - 0,300 г
соединение 4 - 0,300 г
изопропилмиристат - 36,400 г
силиконовое масло ("Родосил 47 V 300", продаваемый фирмой Рон-Пуленк) - 36,400 г
пчелиный воск - 13,600 г
силиконовое масло ("Абил 300.000 сст", продаваемый фирмой Гольдшмидт) - 100 г
(д) Неионный крем масло-в-воде
соединение 1 - 0,500 г
соединение 4 - 0,500 г
цетиловый спирт - 4,000 г
моностеарат глицерина - 2,500 г
стеарат ПЭГ 50 - 2,500 г
масло сального дерева - 9,200 г
пропиленгликоль - 2,000 г
метиловый эфир параоксибензойной кислоты - 0,075 г
пропиловый эфир параоксибензойной кислоты - 0,075 г
стерильная деминерализованная вода - до 100 г2

Формула изобретения

1. Фармацевтическая композиция, модулирующая пролиферацию и/или дифференциацию клеточных систем типа HL-60, и, в частности, предназначенная для терапевтического лечения острой промиелоцитарной лейкемии, содержащая по крайней мере один лиганд, обладающий селективной активностью к рецепторам RXR_s, и по крайней мере один второй лиганд, обладающий селективной активностью к рецепторам RAR-α, в фармацевтически приемлемом носителе.

2. Композиция по п. 1 в форме, удобной для системного применения.

3. Композиция по п. 1 в форме, удобной для местного применения.

4. Композиция по п. 3, содержащая указанный первый лиганд в количестве 0,001 - 10 мас.%.

5. Композиция по п. 3 или 4, содержащая указанный второй лиганд в количестве 0,001 - 10 мас.%.

6. Фармацевтическая композиция по любому из пп. 1 - 5, в которой указанный первый лиганд выбран из группы, включающей 4-[(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафтил) карбонилэтиленацеталь] бензойную кислоту, (E)-2-[(3,5,5,8,8-пентаметил-5,6,7,8-тетрагидро-2-нафтил)-1-пропенил] -4-тиофенкарбоновую кислоту и 4-[(3,5,5,8,8-пентаметил-5,6,7,8-тетрагидро-2-нафтил)карбонил]бензойную кислоту.

7. Композиция по любому из пп. 1 - 6, в которой указанный второй лиганд с селективной активностью к RAR-α выбран из группы, включающей 4-[(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафтил)карбоксамидо] бензойную кислоту и 4-[(5,6,7,8-тетрагидро-5,5,8,8-тетраметил-2-нафтил)карбамоил] бензойную кислоту.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4